李可峰 王玉站 王趙靜 呂晨曦 鄭淑倩 劉洋 葛新發(fā) 潘衛(wèi)東 李姍姍 董貴俊

1 山東體育學(xué)院（山東濟南250063）

2 中國科學(xué)院電工研究所生物醫(yī)學(xué)工程部

3 泰山護理職業(yè)學(xué)院公共教學(xué)部 4 濰坊護理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部

離心運動誘發(fā)的骨骼肌損傷是骨骼肌微損傷中的常見類型，通常伴有骨骼肌肌力下降、酸痛、收縮范圍減小，是影響運動員大強度訓(xùn)練的關(guān)鍵因素之一[1]。 骨骼肌微損傷的癥狀可以自行緩解并消除， 通常稱為自體修復(fù)[2]。大強度離心運動導(dǎo)致肌節(jié)重塑過程中，自體修復(fù)速率與肌細(xì)胞細(xì)胞器重塑存在一定相關(guān)性[3，4]，且線粒體的恢復(fù)速度先于肌節(jié)重建[5，6]，并伴隨著蛋白質(zhì)代謝過程、 肌細(xì)胞外的炎癥過程和工作肌的疼痛過程。 其中，蛋白質(zhì)代謝在自體修復(fù)中起關(guān)鍵作用，降解Z帶撕裂產(chǎn)生損傷蛋白，以防止蛋白質(zhì)合成受到抑制，而其合成過程并未被充分闡明[7]。 重建蛋白質(zhì)表達(dá)時間、種類及強度等需要進(jìn)一步研究， 以確定骨骼肌微損傷重建修復(fù)過程中蛋白質(zhì)重建過程[8]。在離心運動肌肉收縮過程中，肌細(xì)胞能量代謝紊亂，特別是線粒體損傷造成的能量供給減少，是造成骨骼肌微損傷的重要原因[9]。 因此， 探討微損傷修復(fù)過程中損傷組織超微結(jié)構(gòu)變化與蛋白質(zhì)代謝過程， 對于深入了解微損傷修復(fù)機制具有重要意義。本研究采用Wistar大鼠進(jìn)行一次大強度離心運動， 觀察運動后1周內(nèi)骨骼肌損傷后自體修復(fù)過程，通過股四頭肌超微結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)組代謝動力學(xué)變化同步研究， 分析在骨骼肌微損傷修復(fù)的不同階段參與微損傷自體修復(fù)的蛋白質(zhì)類型、表達(dá)強度和時間特異性，探討骨骼肌微損傷自體修復(fù)中蛋白質(zhì)組變異的機制，從而進(jìn)一步了解微損傷修復(fù)過程中蛋白質(zhì)代謝的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗分組、運動方案

5 周 齡 雄 性Wistar 大 鼠 [許 可 證 號：SCXK （魯）20090001]，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，在山東體育學(xué)院運動人體科學(xué)重點實驗室動物房飼養(yǎng)， 隨機分為安靜對照組（D組）、運動后即刻組（0 h組）、運動后24 h組（24 h組）、運動后48 h組（48 h組）、運動后72 h組（72 h組）及運動后168 h組（168 h組），每組6只，共計36只。 D組不進(jìn)行針對性大強度離心運動， 其余組大鼠一次大強度離心運動方案參照葛新發(fā)方法進(jìn)行[10]，跑臺下坡跑，坡度-16度，速度18 m/min，運動持續(xù)60 min。0 h組、24 h組、48 h組、72 h組、168 h組分別在運動后即刻以及相應(yīng)時間斷頭處死，D組與0 h組同時處死。。

1.2 電鏡標(biāo)本制備

取處死大鼠股四頭肌并切為直徑1 mm左右塊狀樣品， 于3.5%戊二醛中固定過夜， 用0.1 M磷酸緩沖液（pH=7.2）間隔20 min沖洗，共沖洗5次，隨后經(jīng)1%鋨酸固定4 h， 再次重復(fù)上述沖洗步驟， 乙醇脫水。 采用Epon812樹脂對樣品進(jìn)行浸透、包埋、聚合并切片（LKB超薄切片機），3%醋酸鈾-檸檬酸鉛對樣本進(jìn)行染色。JEM—1200EX透射電子顯微鏡及成像系統(tǒng)（JEOL，Japan）觀察并拍照片，分析不同組別骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)[11]。

1.3 蛋白樣品制備、電泳

取股四頭肌樣品200 mg，經(jīng)蛋白質(zhì)提取、真空干燥后用Bradford法定量[12]，分裝，并于-80℃冰箱保存。測定時，樣品水化12 h后，在Bio-RAD蛋白質(zhì)分離系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分離，膠條為非線性ph4-7膠條，上樣量為4 mg蛋白質(zhì)。 等電聚焦電泳程序步驟：300 V 1 h，600 V 2 h，1000 V 1 h，8000 V 1 h（梯度），8000 V，4 h，500 V，20 h，累計51900 Vh。 SDS-PAGE程序設(shè)置：U = 800 V，I = 25 mA per gel，P = 200 W，T = 4：00。 固定40 min，考馬斯亮藍(lán)染色50 min，脫色1.5 h。

1.4 雙向電泳蛋白質(zhì)圖像分析

采用GS-710光密度儀256色灰度和600 DPI分辨率對考馬斯亮藍(lán)染色后的電泳凝膠進(jìn)行透射掃描。 掃描后利用Imagemaster2D platinumV5.0軟件對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行點檢測、背景消減，建立平均凝膠后進(jìn)行匹配、量化獲取斑點的相關(guān)信息處理。 以D組電泳圖譜作參考， 進(jìn)行特異蛋白質(zhì)表達(dá)量分析并對表達(dá)受到激活或者抑制的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定。

1.5 特異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析

利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對表達(dá)量具有顯著性差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析， 通過Mascot搜索引擎進(jìn)行查詢相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已有蛋白質(zhì)匹配情況， 蛋白質(zhì)信息經(jīng)NCBI Protein數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢。 查詢參數(shù)主要包括：物種來源鼠；胰蛋白質(zhì)酶水解；酶解片段不完全選擇為1；肽片段相對分子質(zhì)量最大允許誤差控制在±0.1Da。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用ImageMaster 2D Platinum V5.0分析軟件檢驗差異蛋白點相對含量的差別是否有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 骨骼肌微損傷修復(fù)過程中超微結(jié)構(gòu)變化

圖1 微損傷后大鼠股四頭肌超微結(jié)構(gòu)變化（×5000）

對照組在無運動刺激情況下，肌細(xì)胞核、肌節(jié)、肌纖維、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰（見圖1a）。 運動后即刻，大鼠股四頭肌肌細(xì)胞核及肌節(jié)清晰可見， 無明顯變化，Z線清晰，基本未發(fā)現(xiàn)肌絲溶解；線粒體基本正常，未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹（見圖1b）。 運動后24 h，部分肌節(jié)紊亂甚至消失，Z線斷裂，肌絲溶解；線粒體遭到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)高度水腫，嵴開始溶解，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，外膜不完整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊；細(xì)胞膜出現(xiàn)局部溶解現(xiàn)象（見圖1c）。 運動后48 h，肌節(jié)明顯萎縮；線粒體有受損跡象，但其結(jié)構(gòu)逐漸清晰，外膜和嵴已顯現(xiàn)（見圖1d）。 運動后72 h，I帶出現(xiàn)過度收縮現(xiàn)象，肌節(jié)清晰，Z線逐漸清晰；線粒體數(shù)量基本恢復(fù)，但外膜未完全修復(fù)（見圖1e）。 運動后168 h，細(xì)胞核恢復(fù)，Z線清晰可見，明暗帶分明，肌節(jié)清晰；線粒體數(shù)量進(jìn)一步恢復(fù)， 線粒體空泡化基本消失 （見圖1f）。

2.2 一次大強度離心運動后蛋白質(zhì)組差異情況

2.2.1 一次大強度離心運動后0 h組蛋白質(zhì)組差異情況

圖2 0 h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)一次大強度離心運動后即刻， 大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中49種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（圖2）。 其中，44種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，表觀等電點為pH 4.3～6.2，表觀分子量為25～64kDa；5種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，表觀等電點為pH 4.9～6.0，表觀分子量為23～66 kDa。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到22種特異蛋白質(zhì)信息中 （表1），I類蛋白質(zhì)4種，其中血色素結(jié)合蛋白（hemopexin）、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase） 及6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶 （6-phosphogluconolactonase）3種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.9～24.7倍；3-羥基異丁酸脫氫酶（3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase）表達(dá)量下調(diào)至對照組的0.53倍。 II類蛋白質(zhì)13種（占特異蛋白質(zhì)總數(shù)的58.3%）， 其中維生素D結(jié)合蛋白（vitamin Dbinding protein）、膜聯(lián)蛋白A5（Annexin A5）、α1抗胰蛋白 酶 前 體 （alpha-1-antitrypsin precursor）、DJ-1 蛋 白（Protein DJ-1）、 熱 休 克 蛋 白β1 （heat shock protein beta-1）、 著絲粒關(guān)聯(lián)蛋白E （Centromere-associatedprotein E）、α2-HS-糖蛋白（alpha-2-HS-glycoprotein）、乙酰水解酶 （Platelet-activating factor acetylhydrolase IB）及免疫球蛋白λ輕鏈蛋白質(zhì)（immunoglobulin lambda light chain） 表達(dá)量上調(diào)2.0～12.0倍之間；III類蛋白質(zhì)6種，其中，膜聯(lián)蛋白A5和Trim 72蛋白（Tripartite motifcontaining protein 72）表達(dá)量分別上調(diào)2.6倍和4.1倍，核糖體蛋白（39S ribosomal protein）表達(dá)量下調(diào)至0.32倍；IV類蛋白質(zhì)2種，包括角蛋白9（keratin 9）。

表1 0 h組與D組特異表達(dá)蛋白質(zhì)信息比較

2.2.2 一次大強度離心運動后24 h組蛋白質(zhì)組差異情況

一次大強度離心運動后24 h， 大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中64種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（圖3）。其中，39種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)， 表觀等電點在pH 4.2～6.5，表觀分子量在25～110 kDa；25種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，表觀等電點在pH4.1～6.8，表觀分子量在21～86 kDa。

圖3 24 h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜

表2 24 h組與D組特異表達(dá)蛋白質(zhì)信息比較

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到25種特異蛋白質(zhì)信息中（表2），I類蛋白質(zhì)11種，其中輔酶Q9（Coq9 protein）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADH dehydrogenase）、乙?；D(zhuǎn)移酶 （acetyltransferase）、 異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）、 磷 酸 甘 油-3 脫 氫 酶 （glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD（+）]）、血色素結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)2.3～3.9倍， 磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephosphate isomerase）、 腺 苷 酸 激 酶 同 工 酶1 （Adenylate kinase isoenzyme 1）、Tpi1蛋白（Tpi1 protein，partial）、磷酸乙醇酸磷酸酶（phosphoglycolate phosphatase）表達(dá)量下調(diào)至對照組0.32～0.56倍；II類蛋白質(zhì)10種， 其中蛋白酶體（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6）、免疫球蛋白λ 輕鏈、 胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（Chloride intracellular channel protein 1）、 葡 萄 糖 調(diào) 節(jié) 蛋 白（glucose-regulated protein） 及 磷 酸 酶2C 蛋 白（Ppm2c protein）表達(dá)量上調(diào)1.9～4.7倍，過氧化物酶體雙功能酶（peroxisomal bifunctional enzyme）、 磷酸乙醇酸磷酸酶和乙基丙二酸腦病蛋白 （protein ETHE1）3種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)至0.30～0.56倍；III類蛋白質(zhì)5種，其中，胞內(nèi)氯離子通道蛋白1表達(dá)量上調(diào)1.9倍，核糖體蛋白和過氧化物酶體雙功能酶表達(dá)量下調(diào)分別至0.37和0.30倍；IV類蛋白質(zhì)4種，包括蛋白FAM195B。

2.2.3 一次大強度離心運動后48 h組蛋白質(zhì)組差異情況

圖4 48 h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜

一次大強度離心運動后48 h， 大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中41種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（圖4）。其中，33種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，表觀等電點在pH4.6～6.8，表觀分子量在22～69 kDa；8種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，表觀等電點在pH4.9～6.8，表觀分子量在20.1～55 kDa。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到16種特異蛋白質(zhì)信息中（表3），I類蛋白質(zhì)6種，其中異檸檬酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白及乙酰基轉(zhuǎn)移酶共5種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.1～3.4倍，腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)量下調(diào)至對照組0.26倍；II類蛋白質(zhì)7種，其中蛋白酶體β6、 已異戊二烯二羥安息香酸甲基轉(zhuǎn)移酶 （hexaprenyldihydroxybenzoate methyltransferase）、維生素D結(jié)合蛋白、 磷酸酶2C蛋白及結(jié)合珠蛋白前體（haptoglobin precursor）共5種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)2.0～4.9倍，熱休克蛋白β-2（heat shock protein beta-2）和熱休克蛋白β-1共2種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)至0.56倍和0.37倍；III類蛋白質(zhì)4種，Trim72蛋白（Tripartite motif-containing protein 72）、Ⅱ型細(xì)胞骨架1角蛋白（Keratin）、維生素D結(jié)合蛋白表達(dá)量上調(diào)3.4～5.6倍， 核糖體蛋白表達(dá)量下降至0.63倍。

表3 48 h組與D組特異表達(dá)蛋白質(zhì)信息比較

2.2.4 一次大強度離心運動后72 h組蛋白質(zhì)組差異情況

一次大強度離心運動后72 h， 大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中36種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（圖5）。其中，32種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)， 表觀等電點在pH 4.3～6.2，表觀分子量在27～59 kDa；4種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，表觀等電點在pH4.6～6.2，表觀分子量在20.1～29 kDa。

圖5 72 h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到18種特異蛋白質(zhì)信息中（表4），I類蛋白質(zhì)6種，其中異檸檬酸脫氫酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、血色素結(jié)合蛋白、 輔酶Q9和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶共5種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.4～4.0倍，磷酸丙糖異構(gòu)酶表達(dá)量下調(diào)至對照組的0.30倍；II類蛋白質(zhì)5種，其中維生素D結(jié)合蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶2C蛋白及鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase）表達(dá)量上調(diào)2.8～6.9倍；III類蛋白質(zhì)7種，胎球蛋白A、核糖體蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、肌球蛋白1/3輕鏈（myosin light chain）、載 脂 蛋 白A -I 前 蛋 白 原 （apolipoprotein A -I preproprotein）、 鳥嘌呤脫氨酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白29（endoplasmic reticulum resident protein 29）表達(dá)量上調(diào)1.8～4.1倍。

表4 72 h組與D組特異表達(dá)蛋白質(zhì)信息比較

2.2.5 一次大強度離心運動后168 h組蛋白質(zhì)組差異情況

一次大強度離心運動后168 h，大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中16種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（圖6）。其中，11種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)， 表觀等電點在pH 4.1～6.5，表觀分子量在25～57 kDa；5種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，表觀等電點在pH 4.6～6.2，表觀分子量在22～38 kDa。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到7種特異蛋白質(zhì)信息中（表5），I類蛋白質(zhì)中異檸檬酸脫氫酶和輔酶Q9蛋白質(zhì)表達(dá)分別上調(diào)2.3和3.3倍， 腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)量下調(diào)至對照組0.33倍；II類蛋白質(zhì)3種， 其中肌鈣腔蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶及鳥嘌呤脫氨酶表達(dá)量上調(diào)2.5～3.8倍；III類蛋白質(zhì)和IV類蛋白質(zhì)中分別有鳥嘌呤脫氨酶和14-3-3ε蛋白表達(dá)量分別上調(diào)3.8倍和2.3倍。

圖6 168 h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜

表5 168 h組與D組特異表達(dá)蛋白質(zhì)信息比較

2.2.6 一次大強度離心運動后特異蛋白質(zhì)表達(dá)情況匯總

一次大強度離心運動后即刻至1周之內(nèi)，蛋白質(zhì)表達(dá)主要以上調(diào)為主，蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)主要在運動后24～48 h之間（圖7）。 從蛋白質(zhì)表達(dá)種類分析，I類蛋白質(zhì)差異性表達(dá)上調(diào)次數(shù)為25次，下調(diào)表達(dá)次數(shù)8次，特別是運動后24～48 h之間上調(diào)表達(dá)次數(shù)為13次，占上調(diào)表達(dá)次數(shù)的56.5%；II類蛋白質(zhì)在運動后即刻表達(dá)上調(diào)為主，表達(dá)上調(diào)蛋白數(shù)量為14種，未出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)，隨后上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)量逐漸下降，而在24 h時出現(xiàn)4個下調(diào)蛋白；III類蛋白質(zhì)表達(dá)主要體現(xiàn)在48 h組和72 h組，上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量分別為4種和7種，下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量分別為1種和0種。

圖7 一次大強度離心運動后大鼠股四頭肌特異蛋白質(zhì)分類表達(dá)情況

對特異表達(dá)蛋白質(zhì)變化頻次分析發(fā)現(xiàn) （表6）， I類蛋白質(zhì)中分別有異檸檬酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白、輔酶Q9、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、乙?；D(zhuǎn)移酶在微損傷后24～72 h之間表達(dá)活躍并以表達(dá)量上調(diào)為主，腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)以下調(diào)為主；II類蛋白質(zhì)中磷酸酶2C蛋白、熱休克蛋白β-1、免疫球蛋白λ輕鏈、結(jié)合珠蛋白前體、維生素D結(jié)合蛋白、鳥嘌呤脫氨酶表達(dá)頻次較高，其中熱休克蛋白β-1在0 h表達(dá)量上調(diào)，至48 h表達(dá)量下降至正常水平的0.37倍，其余蛋白表達(dá)量在0h時均有顯著上升，在24～72 h之間各蛋白表達(dá)規(guī)律不盡相同，主要以表達(dá)上調(diào)為主；III類蛋白質(zhì)中核糖體蛋白在0～48 h之間表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降，在72 h時表達(dá)量上調(diào)至對照組的2.8倍。

表6 特異性蛋白質(zhì)表達(dá)頻次及表達(dá)時間對應(yīng)表

3 討論

大強度下坡跑可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化， 這種變化與骨骼肌損傷修復(fù)過程中炎癥消除、 肌纖維重建過程密切關(guān)聯(lián)， 說明機體對大強度離心運動造成的微損傷能通過機體自身調(diào)節(jié)進(jìn)行補償[7，8，13]。 離心運動造成微損傷修復(fù)過程中，骨骼肌中鈣蛋白酶（Calpain）和泛素蛋白（Ubiquitin）的動態(tài)變化幾乎與骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化相一致， 揭示著蛋白質(zhì)代謝水平的變化可能與結(jié)構(gòu)恢復(fù)存在關(guān)聯(lián)[14]。 本研究借助蛋白質(zhì)組學(xué)手段， 對一次大強度離心運動引發(fā)的骨骼肌微損傷后自體修復(fù)過程中蛋白質(zhì)組變異進(jìn)行研究， 通過對特異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能劃分， 結(jié)合微損傷恢復(fù)過程中骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化， 試圖發(fā)現(xiàn)骨骼肌微損傷自體修復(fù)過程中結(jié)構(gòu)修復(fù)和不同類型蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)性， 揭示骨骼肌微損傷自體修復(fù)過程中不同功能蛋白質(zhì)組的動力學(xué)變化。

大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)在運動后即刻組中未見有明顯變化，說明運動后即刻微損傷尚未完全顯現(xiàn)[15]。 但在運動后即刻，參與細(xì)胞損傷修復(fù)的蛋白質(zhì)（II類）占特異蛋白質(zhì)總數(shù)的58.3%，其中膜聯(lián)蛋白A5、維生素D結(jié)合蛋白、α1抗胰蛋白酶前體、DJ-1蛋白、乙酰水解酶、免疫球蛋白λ輕鏈、磷酸酶2C蛋白、熱休克蛋白β-1、著絲粒關(guān)聯(lián)蛋白E、鋅指蛋白、α2-HS-糖蛋白、結(jié)合珠蛋白前體表達(dá)量上調(diào)。 膜聯(lián)蛋白A5參與調(diào)控炎性反應(yīng)及細(xì)胞分化過程、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白間相互作用；維生素D結(jié)合蛋白可增強中性粒細(xì)胞的趨化活性， 并且激活巨噬細(xì)胞；DJ-1蛋白由PARK7基因編碼， 屬肽酶C56的蛋白質(zhì)家族，功能目前尚不完全清楚，可作為一個積極的雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子， 也可用作氧化還原敏感的分子伴侶，氧化應(yīng)激傳感器，保護神經(jīng)元免于氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡； 乙酰水解酶通過降解血小板活化因子（PAF）從而避免PAF與靶細(xì)胞膜上的PAF受體結(jié)合引起的血小板聚集，中性粒細(xì)胞聚集和釋放，產(chǎn)生大量活性氧。 本實驗中發(fā)現(xiàn)運動后24 h，II類特異蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)量較0 h組出現(xiàn)下降， 而24 h組超微結(jié)構(gòu)變化較對照組出現(xiàn)顯著變化， 表現(xiàn)為部分肌節(jié)紊亂甚至消失，Z線斷裂，肌絲溶解，線粒體遭到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)高度水腫，嵴開始溶解，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，外膜不完整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊，細(xì)胞膜出現(xiàn)局部溶解現(xiàn)象，說明II類蛋白質(zhì)表達(dá)與超微結(jié)構(gòu)變化不完全同步，II類蛋白質(zhì)表達(dá)先于超微結(jié)構(gòu)變化。

運動后24～72 h， 骨骼肌中線粒體遭到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)高度水腫，嵴開始溶解，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，外膜不完整現(xiàn)象逐漸恢復(fù)至線粒體嵴逐漸清晰， 外膜基本完整， 說明這個階段是損傷骨骼肌亞細(xì)胞恢復(fù)的主要時期[16]。 與此同時，損傷修復(fù)過程中能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)（I類）表達(dá)在此階段較為活躍。 特別是24 h時，I類蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)主要屬于有氧代謝系統(tǒng)的主要酶類，如輔酶Q9、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸甘油-3脫氫酶。其中，輔酶Q在體內(nèi)呼吸鏈中質(zhì)子移位及電子傳遞中起重要作用，是細(xì)胞呼吸和代謝的激活劑，也是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強劑； 血色素結(jié)合蛋白存在于人血清中的高豐度β1糖蛋白，對血紅素有高親和力，因此對人體利用氧的能力起關(guān)鍵作用； 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶通過對NADH 作用進(jìn)行脫氫生成NAD+，從而在呼吸鏈中使黃素、醌、細(xì)胞色素逐步被還原，最后氧被還原成水；乙?；D(zhuǎn)移酶是丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合體的主要酶，PDC催化丙酮酸生成乙酰輔酶A的反應(yīng)是線粒體代謝與生長的調(diào)控樞紐； 異檸檬酸脫氫酶在胞液中以NADP+為輔酶， 在線粒體內(nèi)膜中以NAD+為輔酶；磷酸甘油-3脫氫酶主要參與脂肪有氧氧化。 相反，在運動后24 h，磷酸原供能系統(tǒng)酶和參與糖酵解的酶系中，腺苷酸激酶同工酶1、磷酸丙糖異構(gòu)酶及磷酸乙醇酸磷酸酶表達(dá)受到顯著抑制。 在運動后48 h和72 h，異檸檬酸脫氫酶有氧代謝系統(tǒng)酶類表達(dá)仍表現(xiàn)出顯著上調(diào)， 無氧代謝系統(tǒng)酶系統(tǒng)中腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)仍受到顯著抑制。 由此可見， 在運動后24～72 h之內(nèi)（特別是運動后24 h）有氧代謝酶系統(tǒng)表達(dá)受到顯著激活，線粒體超微結(jié)構(gòu)在此期間也逐漸恢復(fù)，說明有氧代謝酶系統(tǒng)功能恢復(fù)可能促進(jìn)了線粒體自身修復(fù)進(jìn)而加快肌纖維再生速度[17]。

與對照組比較，III類蛋白質(zhì)的表達(dá)主要集中在運動后48 h和72 h組內(nèi)。 其中，Trim 72蛋白、Ⅱ型細(xì)胞骨架1角蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、胎球蛋白A、核糖體蛋白、肌球蛋白、載脂蛋白A-I前蛋白原、鳥嘌呤脫氨酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白29在48～72 h之間表達(dá)均出現(xiàn)顯著上升。Trim 72作為一個氧化傳感器在骨骼肌中特定表達(dá)，在細(xì)胞膜修復(fù)中的作用很重要； 肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位，在肌肉運動中起重要作用；載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的蛋白質(zhì)組分， 運載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)。 從結(jié)構(gòu)變化來看，運動48 h后肌節(jié)仍出現(xiàn)明顯萎縮， 線粒體結(jié)構(gòu)逐漸清晰， 外膜和嵴已顯現(xiàn)；運動72 h后切片發(fā)現(xiàn)I帶出現(xiàn)過度收縮現(xiàn)象，肌節(jié)已經(jīng)清晰，Z線逐漸恢復(fù)，線粒體數(shù)量基本恢復(fù)[18]。 因此，III類蛋白質(zhì)表達(dá)與超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)具有一定的相關(guān)性，與金其貫[14]研究結(jié)果類似。

綜上所述， 一次大強度離心運動后的自體修復(fù)過程中， 大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)組和超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)顯著變化， 蛋白質(zhì)組及其功能對應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律依據(jù)蛋白質(zhì)功能不同而呈現(xiàn)不同的同步性規(guī)律。 細(xì)胞損傷修復(fù)蛋白質(zhì)（II類）在運動后0～48 h之內(nèi)受到激活，而超微結(jié)構(gòu)變化主要發(fā)生在48～168 h之間。 線粒體酶系統(tǒng)及能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)（I類）在運動后0～24 h內(nèi)受到顯著激活，而此時線粒體超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)尚未發(fā)現(xiàn)；至48～72 h之間，I類蛋白表達(dá)仍然活躍，線粒體外膜、線粒體嵴基本恢復(fù)， 說明有氧代謝酶系統(tǒng)功能恢復(fù)可能促進(jìn)了線粒體自身修復(fù)，進(jìn)而加快肌纖維再生速度。骨骼肌結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（III類）在運動后24～48 h之內(nèi)表達(dá)活躍，同時超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)速率較快， 說明結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)有助于超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

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