韓 霜，臧素綱，陳 鑫，陳 曦 綜述；周玉貴△，汪曉鶯 審校(.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 400；.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江蘇南通 600)

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循環(huán)microRNAs在糖尿病腎臟疾病診斷中的潛在價(jià)值*

韓 霜1，臧素綱1，陳 鑫1，陳 曦1綜述；周玉貴1△，汪曉鶯2審校(1.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 224200；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江蘇南通 226001)

循環(huán)microRNAs； 糖尿病腎臟疾??； 生物學(xué)標(biāo)志物

糖尿病腎臟疾病(DKD)為糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，早期以腎小球系膜區(qū)增寬、細(xì)胞外基質(zhì)集聚，微量蛋白尿?yàn)榕R床特點(diǎn)，是糖尿病患者的重要死亡原因。目前腎活檢是腎臟疾病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但存在風(fēng)險(xiǎn)。非侵入性的診斷指標(biāo)，以尿微量蛋白定量檢測(cè)為主，但其對(duì)DKD的診斷仍有一定局限性。眾多研究已證實(shí)，microRNAs不僅參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖、代謝、凋亡等一系列生理活動(dòng)的調(diào)控，而且在DKD等多種疾病的病理過程中發(fā)揮著重要作用。近來，有研究發(fā)現(xiàn)microRNAs不僅存在于細(xì)胞內(nèi)，也穩(wěn)定地存在于血清、血漿、尿液、組織液等各類體液中，統(tǒng)稱為循環(huán)microRNAs[1]。本文就循環(huán)microRNAs在DKD診斷中的潛在價(jià)值作一綜述。

1 循環(huán)microRNAs概述

2008年，Mitchell等[2]、Chen等[3]、Gilad 等[4]學(xué)者幾乎同時(shí)報(bào)道了人血清、血漿中可檢出microRNAs。隨后，人的尿液、唾液、羊水、胸水、腦脊液及乳汁等其他體液中相繼被檢測(cè)到一定數(shù)量的microRNAs[5-6]。研究提示，循環(huán)microRNAs是以外泌體(exosome)或微囊泡(microvesicles)的形式包裹在磷脂雙分子膜內(nèi)，通過細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放到血液中[7-8]。而組織損傷過程中釋放出來的循環(huán)microRNAs[9]，可能來自于壞死細(xì)胞的裂解和主動(dòng)釋放等。與mRNA不同的是，循環(huán)microRNAs可以耐受環(huán)境中RNase的降解、極端pH、溫度、反復(fù)凍融、甲醛 浸泡等條件的影響[2-3，9-10]。

目前循環(huán)microRNAs檢測(cè)方法主要有基因芯片技術(shù)、Northern blot、高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。最常用的方法是qRT-PCR，此法特異性和靈敏度高，并且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。qRT-PCR主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和基于poly(A)加尾的RT-PCR方法。這兩種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，但成本高，后者通用性好，適合推廣應(yīng)用。近來，Lusi等[11]發(fā)現(xiàn)用電化學(xué)基因傳感器能夠更加簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)循環(huán)microRNAs，靈敏度可達(dá)0.1 pmol/L。microRNAs檢測(cè)方法的發(fā)展進(jìn)一步為循環(huán)microRNAs成為生物標(biāo)志物提供了可能。

2 microRNAs與DKD

2.1 miR-192 Kato等[12]發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型腎小球中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和miR-192表達(dá)水平均增高，體外實(shí)驗(yàn)以TGF-β刺激系膜細(xì)胞亦可出現(xiàn)miR-192水平增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能抑制Smad 作用蛋白-1(SIP1)和E-box抑制因子(δEF1)的表達(dá)，使得Ⅰ型膠原 (ColⅠ)合成增加。而SIP1基因的3′UTR是miR-192的作用靶點(diǎn)，miR-192可抑制SIP1的表達(dá)，敲除SIP1基因能阻斷TGF-β1介導(dǎo)的鈣黏蛋白(cadherin)下調(diào)。以上研究證實(shí)，TGF-β可通過miR-192下調(diào)SIP1和δEF1，從而增加Ⅰ型膠原α2鏈(Col1a2)的表達(dá)，介導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生。Krupa 等[13]研究表明，腎小管上皮細(xì)胞中miR-192的降低或缺失能夠促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)展。通過對(duì)不同分期DKD患者腎活檢組織microRNAs的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)晚期DKD腎小管上皮細(xì)胞中miR-192顯著降低，miR-192的低表達(dá)與腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球?yàn)V過率相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，經(jīng)TGF-β處理過的腎小管上皮細(xì)胞中miR-192 呈低表達(dá)水平。因此，腎小管上皮細(xì)胞中miR-192的缺乏和丟失是導(dǎo)致腎纖維化一個(gè)重要的因素。近來，李潔等[14]應(yīng)用qRT-PCR法，發(fā)現(xiàn)DKD患者血清miR-192表達(dá)降低。生物信息分析法預(yù)測(cè)靶基因分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號(hào)通路下游基因抗鋅指E盒結(jié)合蛋白1(ZEB-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)和Col I可被miR-192調(diào)節(jié)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同濃度TGF-β刺激均導(dǎo)致系膜細(xì)胞及培養(yǎng)上清miR-192水平顯著下降。

2.2 miR-21 Zhang等[15]的研究首次提供證據(jù)表明，miR-21與早期DKD的潛在作用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均顯示在早期miR-21是下調(diào)的。在糖尿病db/db小鼠模型中，miR-21的過度表達(dá)抑制了系膜細(xì)胞的增殖、降低了24 h尿蛋白排泄率。此研究還證實(shí)，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN 10)為miR-21的靶基因，在miR-21處理過的腎小球系膜細(xì)胞和糖尿病db/db小鼠體內(nèi)，磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)的水平是增加的。研究表明miR-21通過特異性靶向調(diào)控PTEN/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以抑制腎小球系膜增生，提示miR-21可能是一個(gè)新的DKD保護(hù)因子，可成為早期DKD中一個(gè)新的防治靶標(biāo)。Dey等[16]發(fā)現(xiàn)在OVE26 1型糖尿病小鼠的腎皮質(zhì)中miR-21顯著上升，PTEN編碼的腫瘤抑制蛋白減少，纖維連接蛋白(Fn)水平增加。過表達(dá)的miR-21還可增加AKT磷酸化。相反，miR-21海綿體的表達(dá)則抑制上述過程的發(fā)生。此外，miR-21 還抑制PRAS40(Proline-rich-Akt Substate，40 kDa)活性使得TOR復(fù)合體1(TORC1)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致腎細(xì)胞肥大和Fn增多。曾健英等[17]應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)2型DKD患者血漿miR-21，并作ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)2型DKD患者血漿中miR-21較對(duì)照組顯著增高，ROC曲線下面積達(dá)0.822，提示檢測(cè)血漿中miR-21的水平將為DKD的早期腎小管功能受損的診斷和臨床腎功能受損情況的評(píng)估提供更敏感、可靠的指標(biāo)，有利于DKD的早期診斷和早期干預(yù)治療。

2.3 miR-377 Wang等[18]研究表明，在自發(fā)性和STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠模型的腎皮質(zhì)組織以及高糖刺激的人系膜細(xì)胞和原代小鼠系膜細(xì)胞中，miR-377表達(dá)明顯升高。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，系膜細(xì)胞miR-377的過度表達(dá)可抑制與DKD相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而增加Fn的合成。發(fā)生DKD時(shí)，過表達(dá)的miR-377通過抑制p21依賴性激酶(PAK1)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)，間接促使Fn產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度積累，進(jìn)而引起DKD的發(fā)生、發(fā)展。

2.4 其他相關(guān)microRNAs Kato等[19]證實(shí)高糖環(huán)境下培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)mi-29a表達(dá)下調(diào)。Long 等[20]在db/db 小鼠活體腎小球及體外高濃度葡萄糖處理的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-29c 可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累。國(guó)內(nèi)楊陽(yáng)等[21]人通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DKD患者血清中miR-93下調(diào)，可能通過調(diào)控其下游靶基因在DKD發(fā)生過程中起重要作用。Argyropoulos等[22]應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)40例病程大于20年的Ⅰ型DKD患者尿液中的microRNAs，發(fā)現(xiàn)27種(miR-524，miR-429，miR-552，miR-433等)尿液microRNAs在Ⅰ型DKD的不同階段表達(dá)量不同。

3 小 結(jié)

目前，DKD診斷主要是基于循環(huán)中一些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變，但蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性、轉(zhuǎn)錄后修飾引起的變異、標(biāo)本的穩(wěn)定性等在一定程度上限制了其診斷價(jià)值。循環(huán)miRNAs 的發(fā)現(xiàn)，彌補(bǔ)了蛋白質(zhì)標(biāo)志物的不足，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好且樣本易獲取，但其在DKD中的臨床應(yīng)用仍面臨一定的挑戰(zhàn)。首先，目前初步研究表明有多種miRNAs 在DKD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，然而循環(huán)microRNAs在DKD中的作用機(jī)制尚未完全闡明，它們與其他基因表達(dá)調(diào)控因子組成的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)及相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，僅采用一種或幾種microRNAs作為診斷指標(biāo)可能特異性不夠。其次，DKD相關(guān)microRNAs部分研究結(jié)果、結(jié)論不一致的原因尚不十分清楚，但糖尿病的類型及發(fā)展階段，動(dòng)物模型，細(xì)胞類型，標(biāo)本類型，小樣本量，實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)條件等均有可能是重要因素。

現(xiàn)階段microRNAs在DKD中的研究以動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)為主，相信隨著microRNAs在DKD中的作用機(jī)制及臨床意義的進(jìn)一步闡明，循環(huán)microRNAs必將成為DKD診斷及預(yù)后判斷的重要新型無創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)志物，也將為DKD的靶向治療提供新的途徑。

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醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作的基本內(nèi)容

按工作性質(zhì)及其先后順序，可將醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作分為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、收集資料、整理資料、分析資料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是開展某項(xiàng)醫(yī)學(xué)研究工作的關(guān)鍵，包括醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)，醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括研究對(duì)象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測(cè))指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)方法等。收集資料的方法包括各種試驗(yàn)、檢測(cè)或調(diào)查，要求資料完整、準(zhǔn)確、及時(shí)、有足夠數(shù)量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對(duì)、對(duì)資料進(jìn)行分組與匯總等。分析資料即對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)推斷。

江蘇省鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK20130103)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.058

A

1672-9455(2015)10-1464-02

2014-12-16

2015-02-18)

△通訊作者，E-mail:yugui_z@163.com。