王學(xué)鋒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200025)

血栓和止血涉及機(jī)體的凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統(tǒng)等諸方面的功能，其缺陷可以引起出血性或血栓性疾病。雖然相關(guān)的檢測(cè)目前已經(jīng)開展得相當(dāng)廣泛，如何使這些檢測(cè)指標(biāo)在臨床監(jiān)測(cè)中發(fā)揮作用，為臨床疾病的診斷和治療提供準(zhǔn)確的信息，是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者面臨的任務(wù)。

一、血栓和止血檢測(cè)在出血病診斷中的應(yīng)用

出血病由一期止血缺陷和二期止血缺陷導(dǎo)致，前者主要指血管壁和血小板缺陷導(dǎo)致的出血，而后者主要是由凝血、抗凝缺陷所導(dǎo)致。

1.一期止血缺陷 參與一期止血的有血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及纖維蛋白原等，其數(shù)量和質(zhì)量異常均可以導(dǎo)致出血。常用的篩選試驗(yàn)是出血時(shí)間和血小板計(jì)數(shù)。出血時(shí)間的延長(zhǎng)可伴有血小板計(jì)數(shù)升高、正?；蚪档停浅鲅〉膶?shí)驗(yàn)室檢查表現(xiàn)。血小板計(jì)數(shù)增高，部分患者患骨髓增殖性腫瘤(myeloproliterative neoplasms，MPN)，一些伴有JAK2 V617F突變，表現(xiàn)為出血時(shí)間延長(zhǎng)，可有出血、血栓或無(wú)明顯臨床癥狀。血小板計(jì)數(shù)減少最多見于免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia purpura，ITP)患者，是由各種原因引起的體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)自身血小板的抗體所致。ITP的診斷目前多是排除性診斷。使用流式微球技術(shù)檢測(cè)血小板上的自身抗體具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。需要注意的是，相當(dāng)多的患者出血時(shí)間延長(zhǎng)合并血小板計(jì)數(shù)正常，此時(shí)不能忽視先天性或獲得性血小板功能障礙性疾病的存在。前者較多見的是血小板無(wú)力癥，后者常見于各種抗血小板治療過(guò)程中。篩選試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，往往需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行確診。(1)血管性血友病(von willebrand disease，vWD)相關(guān)檢測(cè)主要有血管性血友病因子抗原(von willebrand factor antigen，vWF:Ag)、瑞斯托霉素輔因子、凝血因子Ⅷ活性(factorⅧ coagulant activity，F(xiàn)Ⅷ:C)檢測(cè)及瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)、凝血因子Ⅷ結(jié)合試驗(yàn)、膠原結(jié)合試驗(yàn)和血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)多聚體分析等。根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果，可以將vWD分成1型、2型和3型。(2)血小板無(wú)力癥相關(guān)檢測(cè)，各種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)均無(wú)法引起血小板聚集反應(yīng);血小板膜表面CD41和CD61流式細(xì)胞檢測(cè)明顯降低甚至缺如。基層單位若無(wú)法實(shí)施上述檢測(cè)，顯微鏡下可以觀察到血涂片上血小板散在分布，無(wú)成簇聚集現(xiàn)象。服用抗血小板藥物的患者，不同程度出現(xiàn)血小板聚集功能受抑制的情況。(3)低/無(wú)纖維蛋白原血癥或異常纖維蛋白原血癥患者可有出血時(shí)間延長(zhǎng)或血小板聚集功能異常?；颊叩哪笗r(shí)間(thrombin time，TT)，活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、止血時(shí)間(reptilase time，RT)均有不同程度的延長(zhǎng)，用clauss法結(jié)合免疫比濁法測(cè)定纖維蛋白原含量。

需要指出的是，作為一期止血的篩選試驗(yàn)，出血時(shí)間并未被淘汰，而是方法學(xué)上推薦使用模板法檢測(cè)。國(guó)際上普遍使用PFA-100檢測(cè)血小板功能、抗血小板藥物的療效和vWD，具有操作簡(jiǎn)便、敏感性好和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。近來(lái)該款儀器已經(jīng)升級(jí)換代為PFA-200并在國(guó)內(nèi)通過(guò)注冊(cè)。

2.二期止血缺陷 常用的篩選試驗(yàn)是凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和 APTT測(cè)定。該2項(xiàng)檢測(cè)是各級(jí)醫(yī)院開展頻率最高的凝血常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。根據(jù)兩者同時(shí)檢測(cè)的結(jié)果，可以大致對(duì)凝血因子缺陷癥進(jìn)行分類。進(jìn)一步行單個(gè)凝血因子的檢測(cè)，可以對(duì)各類凝血因子缺陷性疾病作出診斷和鑒別診斷。臨床上最多見的先天性凝血因子缺陷性疾病是血友病A(hemophilia A，HA)，絕大多數(shù)患者為男性，嚴(yán)重者出生后即可起病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)、肌肉和內(nèi)臟反復(fù)出血。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APTT延長(zhǎng)，PT正常，F(xiàn)Ⅷ:C降低，其他所有凝血因子活性正常。需要注意的是，由于各種原因引起的獲得性血友病A(acquired hemophilia A，aHA)往往也表現(xiàn)為APTT延長(zhǎng)和PT正常。一般可以用APTT糾正試驗(yàn)進(jìn)行鑒別，若是一般的HA，患者延長(zhǎng)的APTT可以被等量的正常人混合血漿所糾正，但若是由FⅧ:C抗體導(dǎo)致的APTT延長(zhǎng)，APTT無(wú)法被等量的正常人混合血漿所糾正，這種異常隨著血漿在37℃的孵育更加容易表現(xiàn)出來(lái)。

3.纖維蛋白溶解系統(tǒng)異常導(dǎo)致的出血 纖維蛋白溶解系統(tǒng)組成復(fù)雜，作為該系統(tǒng)敏感的篩選試驗(yàn)，聯(lián)合使用纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物和D-二聚體可以完成。若僅纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物升高，D-二聚體正常，往往提示患者為原發(fā)性纖維蛋白溶解功能亢進(jìn)，此類患者用抗纖維蛋白溶解藥物就能得到較好的效果。如纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物和D-二聚體均顯著升高，并出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原進(jìn)行性降低的情況，需要考慮彌散性血管內(nèi)凝血(disseminate intravascular disease，DIC)的存在。對(duì)纖維蛋白溶解系統(tǒng)各個(gè)成分的檢測(cè)，可以更加明確哪種因素導(dǎo)致了纖維蛋白溶解系統(tǒng)的啟動(dòng)。D-二聚體是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的一個(gè)重要終產(chǎn)物，其水平的升高代表繼發(fā)性纖維蛋白溶解活力增強(qiáng)。該試驗(yàn)敏感性強(qiáng)，但特異性非常低。若僅檢測(cè)到D-二聚體升高就理解為血栓形成，往往會(huì)導(dǎo)致臨床的誤診。需要指出的是，各種品牌的D-二聚體檢測(cè)其結(jié)果的一致性往往不能令人滿意。各種試劑的正常參考范圍和排除靜脈血栓的醫(yī)學(xué)決定水平各異，并非所有試劑均可以用來(lái)排除靜脈血栓形成。具有該種能力的試劑，一定需要經(jīng)過(guò)大量陰、陽(yáng)性標(biāo)本的能力驗(yàn)證并由權(quán)威部門認(rèn)可。

二、血栓和止血檢測(cè)在出血病治療中的作用

缺乏因子的補(bǔ)充替代治療往往是出血病尤其是凝血因子缺陷癥治療的主要手段。以往，出血病是手術(shù)的禁忌證。隨著檢測(cè)技術(shù)和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，禁區(qū)已經(jīng)被打破。在輸注一定劑量的血液制劑后，及時(shí)檢測(cè)患者體內(nèi)凝血因子的水平，若達(dá)到一定高度，就可以抵御手術(shù)出血的風(fēng)險(xiǎn)。圍手術(shù)期定時(shí)檢測(cè)凝血因子的水平并給予維持，可以保障患者圍手術(shù)期的止血安全。相反，若輸注定量凝血因子后，凝血因子的血漿水平未見明顯升高，提示患者體內(nèi)可能存在凝血因子的抑制物存在。若遇該種情況，千萬(wàn)不能貿(mào)然手術(shù)，而是需要查明檢測(cè)結(jié)果異常的原因，及時(shí)給予處理，才能保證手術(shù)的順利實(shí)施。接觸系統(tǒng)的因子如凝血因子Ⅻ、激肽釋放酶原的缺乏往往導(dǎo)致APTT延長(zhǎng)，但由于該類因子對(duì)止血功能貢獻(xiàn)有限，即使缺乏，也不會(huì)導(dǎo)致出血的發(fā)生。所以，并非每個(gè)凝血因子缺乏患者在手術(shù)時(shí)均需進(jìn)行所缺因子的替代治療。

三、血栓和止血檢測(cè)在血栓病診斷中的作用

血栓病臨床上分為遺傳性和獲得性。體內(nèi)主要抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin，AT)、蛋白C(protein C，PC)、蛋白 S(protein S，PS)的先天性缺乏，可以導(dǎo)致血栓性疾病。對(duì)靜脈系統(tǒng)血栓病的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)部分患者具備這種先天性缺陷。但臨床上大部分血栓病是各種獲得性原因?qū)е碌?，常用的血栓和止血檢測(cè)可能無(wú)法檢測(cè)出單一的致栓原因，但可以從血管壁、血小板、凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統(tǒng)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)方面的異常。事實(shí)上，除FⅧ:C，vWF:Ag、纖維蛋白原外，常規(guī)可以選擇的高凝狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo)并不多;所謂止凝血過(guò)程中所形成的分子標(biāo)志物臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有限。目前，血栓彈力圖(thrombelastogram，TEG)可以檢出患者體內(nèi)的凝血功能和/或血小板功能亢進(jìn)，為臨床診療提供依據(jù)。

四、血栓和止血檢測(cè)在血栓病治療中的應(yīng)用

肝素和相對(duì)分子質(zhì)量肝素是最常用的腸外抗凝制劑，其作用主要依賴AT質(zhì)和量的正常。因此，肝素/低相對(duì)分子質(zhì)量肝素抗凝治療實(shí)施以前，必須進(jìn)行AT活性的檢測(cè)。若AT活性低于70%，肝素治療效果降低;AT活性低于50%，則肝素失效。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)這種情況后，要及時(shí)補(bǔ)充含AT制劑，國(guó)內(nèi)主要是血漿。以往，肝素治療的監(jiān)測(cè)指標(biāo)是APTT。但該指標(biāo)目前認(rèn)為有較多局限性。目前，直接檢測(cè)肝素的含量，對(duì)臨床更有指導(dǎo)價(jià)值。同樣，低相對(duì)分子質(zhì)量肝素在一些特殊情況如肥胖、低體重兒童、腎功能缺陷、妊娠患者或治療期間發(fā)生出血或血栓形成的患者也需要實(shí)施監(jiān)測(cè)。由于肝素/低相對(duì)分子質(zhì)量肝素的代謝半衰期較短，臨床實(shí)施檢測(cè)的時(shí)間對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性來(lái)說(shuō)非常重要。一般肝素監(jiān)測(cè)的采血時(shí)間在皮下注射后2或6 h，在預(yù)防或治療血栓時(shí)，其期望的濃度水平分別是0.1 ～0.15 U/mL(2 h)及0.3 ～0.7 U/mL(6 h)。低相對(duì)分子質(zhì)量肝素監(jiān)測(cè)時(shí)間，每天用藥2次者在第1次用藥后3～4 h;每天用藥1次者，在用藥后4～6 h。在預(yù)防血栓時(shí)，抗Xa期望的濃度水平是0.1～0.15 U/mL;治療血栓形成時(shí)，每天用藥1次者抗Xa水平為0.6～1.0 U/mL，每天 2次用藥者抗 Xa水平為0.8～1.3 U/mL。華法林是最常用的口服抗凝藥物，其起效慢，與食物和藥物的相互作用使其在臨床上必須依賴實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)調(diào)節(jié)患者的血藥濃度。PT INR是監(jiān)測(cè)華法林的最常用指標(biāo)。同樣，抗血小板治療的有效性與患者的預(yù)后也是密切相關(guān)的。部分患者服用阿司匹林或氯吡格雷后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)藥物的抵抗，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致血栓事件的再次發(fā)生。目前，可以使用的抗血小板藥物的監(jiān)測(cè)手段有血管舒張劑刺激磷蛋白(vasodilatorstimulated phosphoprotein，VASP)磷酸化程度、TEG和血小板聚集試驗(yàn)等。不同檢測(cè)有其特有的優(yōu)勢(shì)和不足。

五、血栓和止血在優(yōu)生優(yōu)育中的應(yīng)用

由于先天性出血病和血栓病目前尚無(wú)法臨床根治，且該類疾病具有遺傳給后代的特點(diǎn)，如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的手段進(jìn)行優(yōu)生優(yōu)育干預(yù)，阻止患者的出生，是廣大檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者的任務(wù)。以遺傳性出血病為例，血友病A和B臨床最為常見，且其為X染色體伴性隱性遺傳。由于男性僅有一條X染色體，一旦被累及，即成為患者;女性具有2條X染色體，1條被累及，為致病基因的攜帶者，本身不發(fā)病，但可以遺傳給后代。血友病A的基因診斷可以從先證者著手，優(yōu)先檢測(cè)占血友病A重型患者的熱點(diǎn)突變即FⅧ內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1，若陽(yáng)性，直接可以診斷;陰性情況下可以直接行FⅧ外顯子測(cè)序，多數(shù)可以找到突變;仍舊陰性的患者可以通過(guò)MLPA檢測(cè)大缺失以及FⅧ拷貝數(shù)檢測(cè)查找異常;極少數(shù)患者可以通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)異常。若家系中相關(guān)女性被診斷為致病基因攜帶者，可以在其妊娠中期進(jìn)行羊水穿刺，獲得羊水脫落細(xì)胞，尋找是否與先證者具有相同突變來(lái)進(jìn)行診斷。若結(jié)果為血友病患者，可以選擇終止妊娠。FⅨ基因較小，一般通過(guò)直接測(cè)序，多可以診斷。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，血友病的基因診斷一般在直接診斷的基礎(chǔ)上，選擇FⅧ/Ⅸ基因內(nèi)外的多態(tài)性標(biāo)志進(jìn)行間接診斷。在直接診斷與間接診斷二者的結(jié)果相符時(shí)，才可出具基因診斷報(bào)告。目前，植入前基因診斷已經(jīng)在國(guó)內(nèi)起步。其整合了輔助生殖技術(shù)和基因診斷技術(shù)，采取從受精卵中獲取個(gè)別卵裂球進(jìn)行檢測(cè)，將正常卵裂球植入母體子宮的策略。理論上可以徹底阻止單基因遺傳疾病的發(fā)生，母親避免反復(fù)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。在遺傳性出血病和血栓病的優(yōu)生優(yōu)育中，有著極其廣闊的應(yīng)用前景。