加米拉·熱扎克，湃孜萊提·哈斯木，夏 燕，葉爾登切切克，段 玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳產(chǎn)前診斷中心實驗室，烏魯木齊 830054)

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·臨床研究·

新疆地區(qū)1 378例羊水細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素研究

加米拉·熱扎克，湃孜萊提·哈斯木，夏 燕，葉爾登切切克，段 玲△

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳產(chǎn)前診斷中心實驗室，烏魯木齊 830054)

目的 探討新疆地區(qū)孕中期羊水細(xì)胞培養(yǎng)影響因素。方法 該實驗室對1 378例具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦行羊膜腔穿刺，無菌操作下羊水穿刺獲得孕中期羊水14 mL，接種T瓶培養(yǎng)7～9 d。及時處理不合格羊水，規(guī)范培養(yǎng)環(huán)境，嚴(yán)格要求無菌操作。采用消化法收獲細(xì)胞，常規(guī)染色體制片后進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分析核型。結(jié)果 通過消化法培養(yǎng)1 378例羊水細(xì)胞，失敗13例，成功1 365例，成功率99.1%。結(jié)論 羊水細(xì)胞培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)至關(guān)重要，直接影響培養(yǎng)結(jié)局；符合產(chǎn)前診斷適應(yīng)征孕婦的異常率高于正常孕婦，應(yīng)指導(dǎo)其行侵入性產(chǎn)前診斷，確定胎兒核型。

羊水細(xì)胞； 染色體核型； 無菌操作

染色體異常是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一，其發(fā)病率為 0.1%～0.2%[1-2]，符合羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷的異常率可達(dá)3.6%[3-4]。羊水細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制備技術(shù)是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的重要手段。由于羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、羊水中活細(xì)胞少、培養(yǎng)周期長、易污染、分裂相少；且羊水細(xì)胞染色體在收獲、低滲、固定、顯帶、染色等諸多環(huán)節(jié)的制備難度相對于外周血染色體更大，任何環(huán)節(jié)不合適都可能導(dǎo)致失敗。羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功是產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵，如進(jìn)行二次穿刺，可能會錯過最佳穿刺孕周，對孕婦的身體及心理也會造成一定傷害[5]。目前，羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)推廣至我國各地區(qū)，通過對羊水細(xì)胞培養(yǎng)的時機、取材、接種等重要環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，可縮短培養(yǎng)周期，獲得理想細(xì)胞數(shù)量及有效核型，按期出具產(chǎn)前診斷報告，及時為當(dāng)?shù)卦袐D妊娠提供合理指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在本院經(jīng)產(chǎn)前篩查評估結(jié)果為高風(fēng)險的孕婦、高齡孕婦、夫妻患染色體病、不良孕產(chǎn)史，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷高風(fēng)險，或具有其他產(chǎn)前診斷指征的孕婦，孕周均在 18～25周，共1 378例，經(jīng)知情同意后實施羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水。

1.2 方法

1.2.1 羊水細(xì)胞的接種 無菌條件下獲得羊水14 mL分裝于2個無菌離心管2 000 r/min離心10 min，棄上清液，留1～3 mL羊水與沉淀混勻，分別接種于2個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。加入4 mL左右細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、二氧化碳水平為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。羊水細(xì)胞培養(yǎng)方式包括培養(yǎng)瓶消化法與培養(yǎng)皿原位法，本中心將2種培養(yǎng)方法對比培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶消化法比培養(yǎng)皿原位法更容易獲得數(shù)量滿意的分裂相，成功率高，染色體核型顯帶更豐富，同時對大孕周羊水有較好的培養(yǎng)效果，因此決定沿用培養(yǎng)瓶消化法培養(yǎng)羊水細(xì)胞。

1.2.2 羊水細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)現(xiàn)污染羊水的處理 兩瓶羊水細(xì)胞培養(yǎng)6 d后進(jìn)行換液，原上清液合并至另1個新細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，如前2瓶收獲不理想，第3瓶在5～7 d內(nèi)貼壁生長后繼續(xù)收獲，一般7～9 d后陸續(xù)收獲。在觀察收獲過程中，如發(fā)現(xiàn)個別培養(yǎng)瓶受細(xì)菌污染，應(yīng)及時丟棄，收獲備份。如遇血性羊水、羊水雜質(zhì)嚴(yán)重時，觀察到羊水細(xì)胞貼壁后勤換夜，也可得到理想的細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.3 羊水細(xì)胞收獲與制片 秋水仙素作用1 h后，胰酶消化法使羊水細(xì)胞脫落，收集至離心管內(nèi)離心，常規(guī)收獲后滴片、做帶、染色后鏡下分析。

2 結(jié) 果

采用上述方法對臨床采集的1 378例羊水標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，2例因血性嚴(yán)重、胎糞污染等情況，活細(xì)胞數(shù)目較少，收獲不到處于分裂相細(xì)胞；11例羊水因采集羊水的注射器污染；共13例培養(yǎng)失敗，其余 1 365例成功，1次性培養(yǎng)成功率達(dá)到99.1%，培養(yǎng)收獲時間大多數(shù)為7～9 d，每例羊水培養(yǎng)可獲得4～8張染色體玻片，每片可獲20～100個分散較好的分裂相細(xì)胞，完全滿足臨床診斷的要求，符合WS 322.2-2010中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定觀察報告標(biāo)準(zhǔn)數(shù)。1 365例羊水核型分析發(fā)現(xiàn)異常49 例，(不包括多態(tài)性核型)染色體異常率為3.6%，與其他文獻(xiàn)報道相近[6]，高于一般人群新生兒染色體異常的發(fā)生率(0．6%)，表明按照相關(guān)規(guī)范中的診斷指征選擇高危孕婦進(jìn)行胎兒羊水染色體檢查，可顯著提高染色體異常檢出率。

3 討 論

羊水細(xì)胞主要來源于胎兒皮膚、消化道、呼吸道的脫落細(xì)胞，大部分是衰老固縮細(xì)胞，使羊水細(xì)胞培養(yǎng)較其他組織培養(yǎng)(如外周血細(xì)胞、皮膚細(xì)胞)更為困難[7]。影響羊水細(xì)胞成功率的因素較多[8]，如何把握好影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的每個步驟至關(guān)重要。

孕中期(18～24周)的羊水中，羊水細(xì)胞量多，羊水中有形成分(如胎脂)少，有利于羊水細(xì)胞貼壁成活。本中心接診孕婦的孕周一般控制在19周以上，24周以下，此時期的羊水接種后生長情況大致相同，一般不需區(qū)別對待。低于18周的孕婦可建議絨毛細(xì)胞培養(yǎng)或待時機成熟后再行羊水穿刺。大于25周的孕婦可建議行臍血穿刺血細(xì)胞培養(yǎng)染色體診斷。獲取羊水細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)運和接種須嚴(yán)格遵守?zé)o菌規(guī)范操作，以保證羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功。實驗室對羊水細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、無菌離心管、培養(yǎng)瓶等材料嚴(yán)格要求無菌，但羊水抽取時所用的材料(如注射器)卻是臨床容易忽視的問題。

本研究中，有11例羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗，未出染色體核型報告，只獲得熒光原位雜交技術(shù)(FISH)報告；鏡下觀察羊水細(xì)胞，11例羊水均未見貼壁細(xì)胞，細(xì)胞懸液中可見漂浮的上皮細(xì)胞及羊水細(xì)胞，各細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；細(xì)胞質(zhì)中可見黑色顆粒，細(xì)胞數(shù)量中等，在培養(yǎng)基底部可見黑色細(xì)砂狀顆粒，形狀不規(guī)則，逐日增多，有折光性，疑似細(xì)胞碎片；培養(yǎng)液清澈，無細(xì)菌污染征象。為改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境及備份，進(jìn)行換液，抗菌藥物處理后羊水細(xì)胞仍無貼壁生長跡象。此羊水標(biāo)本進(jìn)行一般細(xì)菌培養(yǎng)、支原體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定結(jié)果均為陰性，排除細(xì)菌及支原體等污染可能。張晶等[9]曾報道試驗材料有細(xì)胞毒性時導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗的因素。其同時對同一批號的注射器等試驗材料進(jìn)行了人精子存活試驗，經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，對照管中向前活動精子比率為92%，測試管向前活動精子比率為0，精子存活指數(shù)均為0，從而確定抽取羊水的注射器有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。通常在行羊膜腔穿刺術(shù)時抽取羊水用普通的大容量注射器內(nèi)墊片上涂有少量硅油(起潤滑作用)，筆者認(rèn)為羊水細(xì)胞與硅油長時間接觸后可能會影響羊水細(xì)胞的正常貼壁，造成培養(yǎng)失敗，而1次性無菌注射器因無內(nèi)置黑色膠環(huán)，可保證此環(huán)節(jié)無細(xì)胞毒性侵害羊水細(xì)胞。羊水穿刺獲取羊水后，應(yīng)盡快進(jìn)行接種，一般控制在1 h內(nèi)，以減小外界環(huán)境對羊水細(xì)胞的影響。

較多文獻(xiàn)報道了對血性羊水的處理，但都較為繁雜。筆者認(rèn)為，遇少量至中量血性羊水可不作處理，常規(guī)接種。羊水細(xì)胞在數(shù)日后均可貼壁生長，周期可能較慢，待見到貼壁后積極換液，可得到較滿意的細(xì)胞克隆數(shù)量。羊水細(xì)胞中有形成分較多時，可離心使細(xì)胞分層沉淀，吸取羊水細(xì)胞沉淀部分接種。進(jìn)入收獲期的羊水細(xì)胞需要每天進(jìn)行觀察，以把握最佳收獲時機。通常培養(yǎng)6～9 d后，細(xì)胞進(jìn)入收獲期，每個培養(yǎng)瓶內(nèi)的克隆總數(shù)為20個以上，克隆內(nèi)有大量形態(tài)為魚眼形透亮細(xì)胞，形態(tài)、折光度都適宜時方可收獲。如羊水細(xì)胞不慎老化，可用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞吸管打散后二次貼壁傳代，24 h內(nèi)可收獲。原代細(xì)胞和上清細(xì)胞都可傳代，但隨著傳代次數(shù)增多，可能造成一定比例的假嵌合體[10]。因羊水細(xì)胞貼壁生長，而本研究采用培養(yǎng)瓶法，在收獲時可能出現(xiàn)染色體受到破壞，從而增加羊水核型中出現(xiàn)嵌合體的概率[11]。如因污染等原因，培養(yǎng)2周以上仍無細(xì)胞生長，則傳代培養(yǎng)意義不大，考慮第二次穿刺。

綜上所述，1例合格羊水標(biāo)本是實驗室做出快速準(zhǔn)確產(chǎn)前診斷的前提保證，用合格的注射器及培養(yǎng)基、備份式羊水細(xì)胞收獲及污染羊水細(xì)胞純化等可增加羊水細(xì)胞的貼壁概率，縮短羊水細(xì)胞培養(yǎng)時間，提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率。只有獲得合格的羊水細(xì)胞分裂相才能保質(zhì)保量的完成產(chǎn)前診斷。

[1]Iacovella C,Contro E,Ghi T,et al.The effect of the contents of exomphalos and nuchal translucency at 11-14 weeks on the likelihood of associated chromosomal abnormality[J].Prenat Diagn,2012,32(11):1066-1070.

[2]孫麗娟,王欣,吳青青,等.超聲檢查胎兒頸項透明層厚度在篩查胎兒染色體異常中的價值[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2013,48(11):819-823.

[3]潘小英,鐘燕芳,傅文婷,等.3 405例產(chǎn)前診斷的指征及其結(jié)果評價[J].生殖與避孕,2008,28(5):268-272.

[4]郭茗,楊惠珠,陸建英,等.2 679例羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型結(jié)果分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2008,16(2):44-45.

[5]何日尚,盧桂英,黃永華,等.抽取羊水進(jìn)行產(chǎn)前診斷孕婦的心理問題分析[J].護(hù)理實踐與研究,2007,4(10):83-84.

[6]崔向英,林寶寧.5 000例新生兒臍帶血染色體核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15(5):49.

[7]許由恩.遺傳病的產(chǎn)前診斷與優(yōu)生[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1985:96-97.

[8]劉曉翌,肖曉素,樊尚榮,等.羊水細(xì)胞染色體制備方法的研究[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2004,5(4):296.

[9]張晶,李衛(wèi)凱,謝志威,等.探討提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的方法[J].中國優(yōu)生優(yōu)育,2010,16(1):60-61.

[10]張海燕,鄭陳光,杜娟,等.廣西地區(qū)產(chǎn)前診斷 359 例羊水細(xì)胞染色體異常核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(8):28-29.

[11]蘇文,崔娓,潘麗,等.羊水檢查疑似染色體嵌合體的處理及妊娠結(jié)局[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2012,8,29(4):494-495.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.034

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1673-4130(2016)22-3184-02

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2016-06-19)

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