盈競男 韓新民

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210029）

超高效液相色譜 （ultra performance liquid chromatography，UPLC）法是指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2μm）和超高壓系數(shù)（壓力大于105kPa）的新型液相色譜技術，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究[1]。中藥及其復方作為中醫(yī)臨床用藥的主要形式，體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀和辨證論治的特色，具有多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮藥效的特點。且作為一個高度復雜的化學物質體系，其復雜性不僅表現(xiàn)在組成方劑的化學成分的復雜性及各組分相互關系的復雜性，也體現(xiàn)在方劑與人體相互關系的復雜性[2]?，F(xiàn)對近幾年來超高效液相色譜在中藥及其復方研究中的應用綜述如下。

1 UPLC法評價中藥及其復方提取工藝

鄧少東等[3]以UPLC法測定酸水解前后化橘紅中4種黃酮類成分的含量，均達到良好的分離，認為該法高效、快速、靈敏。劉萍等[4]采用UPLC法測定不同提取工藝提取鉤藤中鉤藤堿含量，結果表明超臨界CO2萃取方法能在接近常溫條件下工作，提取出的鉤藤堿含量高。王店云等[5]使用UPLC采用正交試驗法，考察安神定志靈在不同加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)下的煎出液中黃芩苷的含量變化規(guī)律，確定安神定志靈的最佳煎煮工藝條件。李坤平等[6]采用超高效液相色譜/電噴霧飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC/EST-TOF-MS）對玉屏風方的水煎煮和超聲提取物的主要化學成分進行分析，發(fā)現(xiàn)水煎煮和超聲得到的2種提取物的色譜圖共有峰12個，相對保留時間一致，說明2種方法的提取物化學成分基本相同，就提取物化學成分而言，超聲提取技術適用于玉屏風方的制劑生產(chǎn)。陳楊等[7]運用正交試驗法優(yōu)選黃浦通竅膠囊的提取工藝，以浸膏得出率、浸膏中大黃和石菖蒲有效成分為綜合評定指標，采用UPLC法，得出該制劑最佳提取工藝。汪永忠等[8]使用UPLC法，對陽和平喘顆粒的提取工藝進行研究，通過分析正交實驗設計法的結果，得到8倍量的80%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5h的最佳提取工藝。趙祥軍等[9]使用UPLC法，以5種生物堿的總量作為評價指標，對左金丸的水提、70%乙醇提取、鹽酸-甲醇（1∶100）提取、半仿生提取方法進行比較，認為鹽酸-甲醇（1∶100）提取方法優(yōu)于其他3種。

運用UPLC法對各提取工藝進行比較，不僅能提高分析效率，節(jié)省分析時間，減少溶劑損耗，降低分析成本，更能優(yōu)化總結出最佳提取方案，為中藥及復方的質量標準建立和藥效學研究奠定了良好的基礎。

2 UPLC法測定中藥及其復方有效組分成分、含量

盧林等[10]采用UPLC法測定地黃中梓醇的含量，在最優(yōu)化條件下，梓醇與其他峰均能達到基線分離，其色譜峰形好，梓醇的含量在3.06～18.36μg時與峰面積呈良好的線性關系。閆利利等[11]利用超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀聯(lián)用技術（UPLC/Q-TOF-MSE）在相同實驗條件下對半夏瀉心湯及其組方各單味藥的色譜圖進行比較分析，鑒定了74個色譜圖，主要成分包括黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類、糖苷類，較全面地闡明半夏瀉心湯的化學組分，為半夏瀉心湯的藥效物質基礎研究和質量控制奠定了基礎。岑衛(wèi)健等[12]采用UPLC-MS/MS法同時測定益氣養(yǎng)血口服液中淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芪甲苷Ⅱ、五味子醇甲和麥冬皂苷D 5種有效成分含量。在最優(yōu)化條件下，用Agilent Zorbax RRHD E-clipse Plus C18色譜柱，流動相為乙腈和0.2%甲酸的水溶液，梯度洗脫，各組分的線性范圍分別為0.003～12mg/L、0.3～12mg/L、0.009～18mg/L、0.006～12mg/L、0.003～3.0mg/L； 檢出限分別為 1μg/L、1μg/L、3μg/L、2μg/L、1μg/L。 何丹等[13]應用 UPLC 法測定藿香正氣口服液中尿苷、鳥苷和腺苷含量，其以ACQUITY UPLC BEH C18為色譜柱，流動相為水-甲醇梯度洗脫，柱溫30℃，體積流量0.5mL/min，檢測波長為254nm，分析得到尿苷在 10.29～102.9μg/mL、鳥苷在5.73～57.3μg/mL、 腺苷在 5.03～50.3μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。陳曉虎等[14]利用UPLC同時測定梔子金花丸中11種成分，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫，被測定的11種成分色譜峰均有良好的分離度，且有較寬的線性范圍和良好的線性關系。張紫佳等[15]運用UPLC測定青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量。樣品經(jīng)前處理后，采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分離，以乙腈-水（使用磷酸調(diào)pH值至4.0，9∶91，v/v）為流動相，流速為0.1mL/min，檢測波長為227nm，柱溫為25℃，進樣量為0.5μL，松脂醇二葡萄糖苷在1.40～506.00mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。施玉旋等[16]以UPLC法測定“柴胡-白芍”藥對提取物的3中皂苷類成分。方法是采用Waters XSELECTTM HSS T3色譜柱，0.1%H3PO4水溶液和乙腈為流動相進行梯度洗脫，柱溫30℃，流速0.4mL/min，檢測波長210nm，分析認為芍藥苷、柴胡皂苷a及柴胡皂苷d三種成分基本分離，線性關系良好。

在中藥及復方化學成分分析中，經(jīng)常出現(xiàn)樣品含量少，分離難度大，分析耗時長的情況，UPLC法能保證分析速度快，分離效率高，檢測靈敏度高，精密、準確，更適合應用于有效成分及含量的分析。

3 UPLC法檢測中藥及其復方的代謝產(chǎn)物

王鈺等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技術分析大鼠灌胃白花蛇舌草環(huán)烯醚萜類提取物后尿液中的E-6-O-對香豆酰雞屎藤苷甲酯（M0）及其代謝產(chǎn)物，在大鼠尿液中檢測到M0、M1（E-6-O-對香豆酰雞屎藤苷甲酯葡萄糖醛酸化產(chǎn)物）、M2（對香豆酸）、M3（對香豆酸硫酸化產(chǎn)物），其中M1和M3均為首次發(fā)現(xiàn)，分析得到M0在大鼠體內(nèi)以葡萄糖醛酸形式代謝，最終以對香豆酸及香豆酸硫酸化產(chǎn)物排出體外。薛璟等[18]采用大鼠在體腸灌流實驗，利用UPLC法測定雷公藤甲素的量，分別研究吸收部位和藥物濃度對雷公藤甲素吸收的影響。研究結果表明4.8、3.20pmol/L雷公藤甲素灌流液在各腸段的有效滲透系數(shù)和10cm腸段吸收百分比（10cm%ABS）依次為：十二指腸＞結腸＞空腸＞回腸，各腸段之間無顯著性差異（P＞0.05），不同質量濃度（4～20μmol/L）的雷公藤甲素在腸道內(nèi)的吸收無顯著性差異（P＞0.05）。苗華等[19]基于UPLC-代謝組學技術和預防性給樣法研究澤瀉提取物（AR）結合有氧運動對高脂血癥的影響，結果顯示不僅AR結合有氧運動對高脂血癥有一定的治療作用，且二者聯(lián)用的治療效果優(yōu)于單一AR組或有氧運動組。鄭林等[20]給大鼠靜脈注射和口服細辛-芍藥提取物后，用UPLC-MS同時測定大鼠血漿中野黃芩苷和芍藥苷含量，研究2種指標成分在大鼠體內(nèi)的藥動學特征及其絕對生物利用度。結果表明，野黃芩苷和芍藥苷2種成分呈良好的線性關系（r＞0.999），絕對生物利用度分別為26.448%和5.38%。辛楊等[21]以黑順片單煎液及其復方煎煮液“術附湯”和“甘草附子湯”灌胃，以大鼠血漿中的次烏頭堿為檢測指標，采用UPLC/Q-TOF MS方法，并以內(nèi)標法對其進行了含量測定，方法學考察結果表明血中次烏頭堿在0.02～10ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，而“甘草附子湯”中的某種或某些成分促進了次烏頭堿的體內(nèi)吸收，兩復方功效差異可能來源于次烏頭堿在體內(nèi)吸收的不同。

運用UPLC法，可通過分析中藥及復方在體內(nèi)代謝成分，探索其藥效作用的更直接作用成分，為進一步闡明其物質基礎提供研究方向。

4 UPLC法建立中藥及其復方的指紋圖譜

馬培等[22]利用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱，乙腈-0.5%乙酸水溶液梯度洗脫，流速為0.3mL/min，紫外吸收波長為290nm，建立了38批不同產(chǎn)地虎杖藥材的UPLC指紋圖譜。結果顯示該批次虎杖藥材共有11個共有峰，其中4個共有峰為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚。36批虎杖藥材相似度＞0.9，2批藥材相似度為0.733、0.896。劉芷等[23]首次建立了五味子的UPLC指征指紋圖譜共有模式，標定了21個共有峰，結合保留時間和紫外光譜分析，指認了五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子γ乙素、五味子乙素和五味子丙素的峰位。19批五味子的相似度均在0.970以上。王露黔等[24]采用UPLC-PDA-ELSD法建立消渴顆粒的指紋圖譜，分別以芒果苷和知母皂苷BⅡ為參照峰，確定了23個紫外檢測共有指紋峰和10個蒸發(fā)檢測共有指紋峰。結果證實19批消渴清顆粒合格，9批不合格；8批消渴清顆粒中有5個主要成分的量有異常，定量測定與指紋圖譜結果具有一致性，可作為消渴清顆粒的質量控制依據(jù)。張寧等[25]利用UPLC-MS對自制10批地黃飲子樣品進行成分分析，共標定了30個共有色譜峰，通過與對照品的保留時間及一級質譜信息的比對，確定了馬錢苷、松果菊苷、烏頭堿、新烏頭堿、五味子醇甲、五味子乙素和茯苓素，所制定的指紋圖譜特征性及專屬性強，可結合含量測定用于全面控制地黃飲子的質量。

目前，指紋圖譜已經(jīng)成為國際公認的中藥或天然藥物質量控制最有效的方法之一。近些年來色譜技術發(fā)展，超高效液相色譜具有較好的分離效率、峰容量及靈敏度，作為一種新的色譜技術應用于中藥及復方指紋圖譜的測定研究有著非常廣闊的前景。

5 討論

中藥及復方具有組分多、有效成分含量低、各組分物理化學性質各異的特點，且大多對環(huán)境（如溫度、pH值等）敏感。近年來隨著分析化學和儀器設備的發(fā)展，一些新型的分析方法被應用到中藥及復方研究領域中來，如化學定量法、紫外分光光度法、薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜法等?；瘜W定量法適用于單味中藥制劑或復方中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機成分的含量測定，但其靈敏度低、操作煩瑣、主屬性差，故不適用于制劑中單體成分、微量及痕量的測定。紫外分光光度法是通過測定吸收度來計算含量的方法，該法靈敏度高、選擇性好、操作簡單，但是準確度相對不高。薄層掃描法進行定性分析，比較直觀、快速、準確，但定量分析無論準確性、穩(wěn)定性還是精密度上都不好，故已取消其定量分析。氣相色譜具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作簡單的優(yōu)點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩(wěn)定性差的物質都無法采用其進行分析。高效液相色譜法（HPLC）主要是利用要測定的指標成分與其他組分在流動相與固定相中的分配系數(shù)不同而把指標成分分離出來并進行含量測定，具有分離效率高、準確性和重現(xiàn)性好、分析速度快、選擇性優(yōu)和靈敏度高的特點，且不受樣品揮發(fā)性的限制，對于高沸點、熱源穩(wěn)定性差的有機物都可應用。故目前在中藥及其復方定性及定量研究方面，HPLC使用的最為廣泛。超高效液相色譜（UPLC）基于HPLC技術，采用1.7μm顆粒度的色譜柱填料，能獲得更高的柱效，并且在更寬的線速范圍內(nèi)柱效保持恒定，因而有利于提高流動相流速，縮短分析時間，提高分析通量，為復雜體系的分離分析提供了良好的平臺。在分析結果的質量、時效性、成本等方面，UPLC較傳統(tǒng)或優(yōu)化的HPLC更出色，故越來越多的研究者采用超高效液相色譜。

隨著藥物分析方法的發(fā)展，UPLC將會在藥物及其復方分析領域中發(fā)揮越來越重要的作用，其能夠快速、精確的對中藥及復方提取工藝進行優(yōu)化，測定有效成分及含量，分析藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物，制定指紋圖譜。但是UPLC在實際應用中也存在一些問題，如由于進樣量過少，且采用半環(huán)進樣的方式，導致峰面積的重復性略差，而且由于填料顆粒極細，導致UPLC柱易堵塞等。但是隨著進樣技術、填料技術等進一步發(fā)展，這些不足將會得到進一步克服。在實際研究過程中，許多研究者將UPLC與質譜聯(lián)用，其高效性、高靈敏度能快速完成眾多復雜成分的分離與鑒定，不僅能夠做定性、定量檢測，而且能夠提供一些分子結構信息。因目前單體對照物有限，故在實驗中對于某些不明的單體或新化合物不能馬上明確其成分，可以以UPLC為分離系統(tǒng)，質譜為檢測系統(tǒng)，二者聯(lián)用經(jīng)檢測器得到質譜圖，提供相對分子質量與結構信息，推算出其化學式，有助于明確其化學成分。通過聯(lián)用技術既可建立中藥及其復方的指紋圖譜，又可進行多種有效成分或指標成分定量，還可用于體內(nèi)藥物分析，為我們研究中藥及復方的有效成分及新藥的開發(fā)提供物質基礎。

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