姜月華， 馬度芳， 楊金龍， 王 雪， 林海青， 曹欣坤， 李 曉△

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011； 2山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

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交感神經(jīng)損毀導(dǎo)致的心肌損傷及桂枝湯的保護(hù)作用*

姜月華1， 馬度芳2， 楊金龍1， 王 雪2， 林海青1， 曹欣坤2， 李 曉1△

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

目的： 觀察桂枝湯對(duì)6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的大鼠心臟去交感神經(jīng)損傷的防治作用。方法: 54只大鼠隨機(jī)均分為6組，彌可保組和桂枝湯各組分別給予彌可保和不同桂芍配伍比例的桂枝湯進(jìn)行藥物干預(yù)，7 d后給予6-OHDA(100 mg/kg)腹腔連續(xù)注射3 d誘導(dǎo)建立心臟交感神經(jīng)損傷模型。免疫組化觀察左心室中酪氨酸羥化酶(TH)分布，ELISA法檢測(cè)心肌中TH、膽堿乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)含量。檢測(cè)血清中心肌酶學(xué)改變，并觀察心肌形態(tài)學(xué)改變(HE染色)。結(jié)果: 6-OHDA成功誘導(dǎo)心臟去交感神經(jīng)，模型組可見(jiàn)左心室中TH和GAP-43明顯降低。各藥物組TH高于模型組，桂枝湯各組GAP-43高于模型組和彌可保組。注射6-OHDA后，模型組出現(xiàn)心肌損傷，血清心肌酶含量明顯升高，HE染色示心肌組織形態(tài)學(xué)異常改變。彌可保組和桂枝湯各組心肌損傷較輕，其中桂芍2∶1組和桂芍1∶1組交感神經(jīng)損傷及心肌損傷最輕。結(jié)論: 去交感神經(jīng)后在一定程度上可造成心肌損傷，桂枝湯(桂芍2∶1和1∶1)可有效減輕6-OHDA誘導(dǎo)的心臟去交感神經(jīng)損傷及交感神經(jīng)失支配后出現(xiàn)的心肌損傷。

桂枝湯； 交感神經(jīng)損傷； 化學(xué)去交感神經(jīng)； 心肌損傷； 6-羥基多巴胺

近年來(lái)，交感神經(jīng)過(guò)度激活被廣為關(guān)注，其所產(chǎn)生的不利影響，可以通過(guò)交感神經(jīng)切除術(shù)或應(yīng)用β受體阻滯劑得以減輕，其療效在臨床得到肯定。然而，關(guān)于交感神經(jīng)損傷對(duì)心肌結(jié)構(gòu)和功能影響的研究卻相對(duì)較少。在糖尿病和心力衰竭晚期以及心肌梗死時(shí)梗死區(qū)局部心肌均存在心臟交感神經(jīng)失支配現(xiàn)象[1-3]。因此防治心臟中交感神經(jīng)損傷，維持正常的自主神經(jīng)支配對(duì)于心臟病的預(yù)后有重要意義。

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)可選擇性破壞腎上腺素能神經(jīng)末端，損傷或阻斷腎上腺素能受體而造成特異性交感神經(jīng)損傷，因此常被廣泛用于化學(xué)去交感神經(jīng)研究[4-5]。已有研究表明，完整的交感神經(jīng)支配可提高清醒大鼠冠脈結(jié)扎后的生存率，而6-OHDA誘導(dǎo)的交感神經(jīng)失支配后可使冠脈結(jié)扎大鼠死亡率增加[6]。我們既往的研究表明，桂枝湯可減輕心肌損傷，降低心肌膠原重構(gòu)和心肌纖維化程度[7-8]。在糖尿病大鼠自主神經(jīng)病變模型和4-甲基鄰苯二酚誘導(dǎo)的心臟交感神經(jīng)芽生模型中[9-10]，桂枝湯可抑制交感神經(jīng)芽生，維持心臟交感-迷走神經(jīng)支配平衡。中醫(yī)臨床實(shí)踐證明桂枝湯具有雙向調(diào)節(jié)作用，因此我們推測(cè)桂枝湯在抑制交感神經(jīng)芽生同時(shí)也會(huì)減輕交感神經(jīng)損傷。為此，本研究以6-OHDA誘導(dǎo)大鼠心臟去交感神經(jīng)模型，探索交感神經(jīng)損傷后心肌組織的改變及桂枝湯對(duì)其保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

6-羥基多巴胺(Sigma)；彌可保(methycobal;衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)；用于檢測(cè)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、膽堿乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl transferase，ChAT)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein 43，GAP-43)的ELISA試劑盒、兔抗大鼠TH I抗、山羊抗兔IgG II抗、5% BSA 牛血清白蛋白和DAB 顯色試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供；SABC 試劑盒(北京中杉金橋)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥 Wistar大鼠54只，雄性，體重250～300 g，購(gòu)自濟(jì)寧魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK 魯20080002。隨機(jī)均分為6組：正常對(duì)照組、去交感神經(jīng)組、彌可保組、桂枝湯2∶1組(桂芍2∶1組)、桂枝湯1∶2組(桂芍1∶2組)和桂枝湯1∶1組(桂芍1∶1組)，各組9只。

彌可保配制為濃度0.03 g/L 的混懸液。桂枝湯組成藥物購(gòu)于山東省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，桂枝湯方組成為桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗，分別按桂芍比例2∶1、1∶2和1∶1水煎煮，至終濃度為1.5 kg(生藥)/L(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室加工制作)。給藥方式：彌可保組每天給予彌可保混懸液按0.15 mg/kg，桂枝湯1∶1 組按4 g/kg灌胃，桂枝湯2∶1組和桂枝湯1∶2組分別按5.5 g/kg灌胃。其余2組給予等量生理鹽水灌胃。持續(xù)給藥7 d后，去交感模型組、彌可保組和桂枝湯各組均腹腔注射6-OHDA(100 mg/kg 溶于0.1%維生素C 的生理鹽水)制作去交感模型，正常對(duì)照組腹腔注射等量1% 維生素C的生理鹽水，連續(xù)注射3d。造模期間繼續(xù)上述藥物灌胃。

2.2 標(biāo)本的留取 注射3 d后，4%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。腹腔抽取下腔靜脈血3 mL，分離血清。由山東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科生化室用Olympus AU 5400生化分析系統(tǒng)檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和心肌型肌酸激酶同工酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)含量。開(kāi)胸取心臟，在冰上操作，在心臟后(左右心房)上1/3 處，成30°取整個(gè)心臟橫截面，這個(gè)角度可以同時(shí)顯示左右心房和心室，剪取左心室(矢狀位均分為2 份)。剪取左心室一半組織，中性甲醛固定；另一半左心室，剪碎后加10倍PBS，T25 勻漿機(jī)(IKA)7 500 r/min，40 s勻漿2次，4 000 r/min離心10 min，留取上清液。

2.3 ELISA 10%左心室勻漿，ELISA法檢測(cè)TH、ChAT和GAP-43的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，ELx808 酶標(biāo)儀(BIO-TEK)測(cè)定450 nm 處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心肌中的TH、ChAT和GAP-43 含量。

2.4 HE染色 左心室進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚度4 μm，脫蠟，蘇木素和伊紅分別染色，并脫水封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色或者紅色。

2.5 免疫組化檢測(cè)TH的表達(dá) 左心室進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，片厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水，3%的H2O2室溫10 min 消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 洗 5 min 3 次，微波修復(fù)抗原，5% BSA 室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠TH I 抗(1∶100 倍稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜，PBS 洗5 min 5 次，滴加山羊抗兔IgG II抗，室溫60 min，PBS 洗5 min 5 次，滴加試劑SABC，室溫30 min，PBS 洗5 min 5次，DAB 顯色，鏡下控制顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS 代替 I 抗作為陰性對(duì)照，以出現(xiàn)棕黃色顆粒沉積者判定為陽(yáng)性部位。隨機(jī)選取5 個(gè)視野用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(中國(guó)武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)進(jìn)行半定量分析，以均值作為該樣本TH的相對(duì)表達(dá)量。TH陽(yáng)性面密度=陽(yáng)性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，在滿足正態(tài)性分布的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett-t檢驗(yàn)。定性資料采用Fisher確切概率法。

結(jié) 果

1 動(dòng)物一般狀況

除去死亡大鼠，共48只大鼠納入實(shí)驗(yàn)，其中正常對(duì)照組9只，彌可保組為7只，其余4組均為8只。注射6-OHDA后，大鼠活動(dòng)下降，精神萎靡，部分大鼠出現(xiàn)肉眼血尿。

2 左心室TH、ChAT和GAP-43含量的檢測(cè)

如表1所示，模型對(duì)照組大鼠心肌勻漿中TH和GAP-43含量顯著下降，分別降低25.00%和43.55%。彌可保組和桂枝湯各組的TH高于模型對(duì)照組(P<0.01)。桂芍1∶1組的TH高于彌可保組(P<0.01)。桂枝湯各組的GAP-43比模型對(duì)照組升高(P<0.01)，且桂芍2∶1和桂芍1∶1組GAP-43高于彌可保組(P<0.05)。

表1 左心室TH、ChAT和GAP-43含量的比較

**P<0.01vsnormal group;△△P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsmethycobal group.

表2 各組大鼠血清心肌酶含量

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group; ▲P<0.05,▲▲P<0.01vsmethycobal group.

3 免疫組化

TH 是合成去甲腎上腺素的限速酶，可作為交感神經(jīng)分布的標(biāo)記物，同時(shí)可反應(yīng)交感神經(jīng)活性[11]。各組大鼠左心室TH免疫組化染色可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠左心室心肌中TH陽(yáng)性明顯減少(P<0.01)，彌可保組和桂枝湯各組TH陽(yáng)性密度高于模型對(duì)照組(P<0.01)，且桂芍組1∶1組明顯高于彌可保組(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

4 各組大鼠血清心肌酶指標(biāo)檢測(cè)

注射6-OHDA后模型對(duì)照組大鼠血清中心肌酶AST、LDH、CK 和CK-MB均明顯升高。彌可保組僅LDH 低于模型對(duì)照組(P<0.05)。桂枝湯組的AST、LDH、CK 和CK-MB均低于模型對(duì)照組(P<0.01)。與彌可保組比較，桂枝湯2∶1和1∶1組LDH 和CK-MB降低(P<0.05)，且桂枝湯1∶1組AST和CK也低于彌可保組(P<0.01)。

5 左心室HE染色

正常對(duì)照組心肌纖維清晰，心肌排列規(guī)則，無(wú)心肌細(xì)胞變性壞死。模型對(duì)照組心肌細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞間隙變寬，大面積心肌纖維結(jié)締組織增生，纖維灶形成。彌可保組局部心肌變性壞死，細(xì)胞間隙變寬，間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生，但輕于模型對(duì)照組。桂枝湯1∶2組心肌局灶性纖維結(jié)締組織形成，桂枝湯2∶1組和桂枝湯1∶1組心肌細(xì)胞排列整齊，纖維結(jié)締組織增生程度輕于模型對(duì)照組和彌可保組，其中桂芍1∶1組心肌纖維結(jié)締組織增生程度最輕，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Immunohistochemical staining of TH positive nerve fibers in the heart (×400). A: normal group; B: model group; C: methycobal group; D: Guizhi decoction 2∶1 group; E: Guizhi decoction 1∶2 group; F: Guizhi decoction 1∶1 group. Mean±SD.n=7～9.**P<0.01vsnormal;△△P<0.01vsmodel;▲▲P<0.01vsmethycobal.

圖1 免疫組化顯示心肌中TH陽(yáng)性神經(jīng)纖維

Figure 2.HE staining of myocardial tissues (×200). A: normal group; B: model group; C: methycobal group; D: Guizhi decoction 2∶1 group； E: Guizhi decoction 1∶2 group; F: Guizhi decoction 1∶1 group.

圖2 心肌組織的HE染色

討 論

桂枝湯出自《傷寒雜病論》，桂枝可溫通心陽(yáng)，芍藥可養(yǎng)血斂陰，依據(jù)中醫(yī)理論，桂枝湯中桂枝和白芍不同比例配伍其溫陽(yáng)或滋陰功效各有偏重。因此本研究中我們選用桂芍2∶1、1∶1和1∶2這3種臨床常用配伍比例，研究不同桂芍配伍比例桂枝湯對(duì)自主神經(jīng)損傷導(dǎo)致心臟中陰陽(yáng)失衡的預(yù)防和治療作用，探索桂枝湯針對(duì)心臟去交感神經(jīng)損傷的最佳配伍比例。

6-OHDA是特異性交感神經(jīng)損毀劑。本研究中，注射6-OHDA后大鼠左心室中TH分布密度和含量明顯降低，而 ChAT沒(méi)有明顯變化，也驗(yàn)證了6-OHDA特異性損傷交感神經(jīng)，對(duì)膽堿能神經(jīng)無(wú)影響的特性。經(jīng)彌可保和桂枝湯預(yù)灌胃大鼠的TH比模型對(duì)照組降低幅度減小，桂枝湯1∶1組和桂枝湯2∶1組TH分布高于彌可保組。GAP-43是神經(jīng)發(fā)育和再生過(guò)程中與軸突生長(zhǎng)有關(guān)的膜結(jié)合蛋白，參與軸突和突觸形成，在生長(zhǎng)的神經(jīng)中GAP-43 表達(dá)增多[12-13]。 GAP-43表達(dá)增加可作為神經(jīng)生長(zhǎng)的標(biāo)志[14]。本研究中，模型對(duì)照組GAP-43相比正常對(duì)照組明顯降低，而桂枝湯各組GAP-43含量明顯高于模型對(duì)照組，且桂枝湯2∶1組和桂枝湯1∶1組GAP-43高于彌可保組。因此，我們推測(cè)桂枝湯(桂芍2∶1和1∶1配伍時(shí))具有顯著的交感神經(jīng)保護(hù)作用，其作用優(yōu)于彌可保。

心肌酶譜的改變是心肌損傷的靈敏指標(biāo)。 本研究發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組大鼠心肌損傷嚴(yán)重，心肌酶顯著升高、心肌細(xì)胞變性壞死且出現(xiàn)心肌纖維化。在應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑彌可保降低交感神經(jīng)損傷程度后，心肌酶學(xué)和左心室形態(tài)學(xué)改變的程度也有所減輕，表明交感神經(jīng)損傷與心肌損傷有關(guān)，交感神經(jīng)損傷可在一定程度誘發(fā)或加重心肌損傷，保護(hù)交感神經(jīng)可在一定程度上減輕神經(jīng)失支配后的心肌損傷。與彌可保相比，桂枝湯桂芍1∶1和2∶1配伍預(yù)治療可明顯降低神經(jīng)失支配后出現(xiàn)的心肌損傷，推測(cè)其對(duì)交感神經(jīng)的保護(hù)作用是其減輕心肌組織損傷的原因之一。

我們認(rèn)為在心臟疾病的治療中除抑制亢進(jìn)的交感神經(jīng)外，還應(yīng)該重視保護(hù)心臟交感神經(jīng)，使心臟交感神經(jīng)支配恢復(fù)到平衡點(diǎn)。我們之前研究證明桂枝湯原方可減輕4-甲基鄰苯二酚誘導(dǎo)的心臟交感神經(jīng)芽生[9]。而本研究顯示桂枝湯可減輕6-OHDA造成的心臟去交感神經(jīng)損傷。由心臟交感神經(jīng)芽生和交感神經(jīng)損毀2個(gè)模型可知，桂枝湯在減輕心臟交感神經(jīng)芽生同時(shí)又可防治交感神經(jīng)失支配，這符合中醫(yī)理論中桂枝湯具有“調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，平衡陰陽(yáng)”的雙向調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)。

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Preventive effect of Guizhi decoction on myocardial injury after chemical sympathectomy

JIANG Yue-hua1, MA Du-fang2, YANG Jin-long1, WANG Xue2, LIN Hai-qing1, CAO Xin-kun2, LI Xiao1

(1AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China;2FirstClinicalMedicalCollege,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China.E-mail:lixiao617@163.com)

AIM: To investigate the preventive effect of Guizhi decoction on myocardial injury after chemical sympathectomy induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). METHODS: Wistar rats (n=54) were randomly divided into 6 groups. Methycobal and Guizhi decoction (with different proportions betweenRamulusCinnamomiandRadixpaeoniaeAlba at 2∶1, 1∶2 or 1∶1) were pre-administered to the rats. Immunohistochemical method was used to observe the cardiac sympathetic nerve distribution. The contents of tyrosine hydroxylase (TH), choline acetylaminotransferase (ChAT) and growth-associated protein 43 (GAP-43) in the left ventricle were measured by ELISA. The serum levels of myocardial enzymes and morphology of myocardial tissues were also observed. RESULTS: 6-OHDA successfully induced cardiac sympathetic denervation as the contents of TH and GAP-43 in the left ventricle declined significantly. Compared with model group, the content of TH was elevated in both methycobal group and Guizhi decoction groups, while the content of GAP-43 was elevated only in Guizhi decoction groups. The serum levels of myocardial enzymes and the histopathological changes of the cardiac tissues were deteriorated after injection of 6-OHDA, indicating that the myocardial injury was established. Methycobal and Guizhi decoction normalized the abnormal change. Guizhi decoctions at 2∶1 and 1∶1 showed the best efficacy. CONCLUSION: 6-OHDA- induced sympathetic denervation causes myocardial injury. Guizhi decoction with the proportions betweenRanulusCinnamomiandRadixpaeoniaeAlba at 2∶1 and 1∶1 effectively alleviate the myocardial injury after cardiac sympathetic denervation induced by 6-OHDA.

Guizhi decoction; Sympathetic injury; Chemical sympathectomy; Myocardial injury; 6-Hydroxydopamine

1000- 4718(2015)04- 0750- 05

2014- 11- 17

2015- 01- 16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81072962)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.031

△通訊作者 Tel: 0531-68616008; E-mail: lixiao617@163.com