阮瓊芳， 趙超莉， 葉子青， 謝瓊慧， 謝衛(wèi)國(guó)

(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院暨武漢市第三醫(yī)院燒傷研究所，湖北 武漢 430060)

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電燒傷大鼠血清誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌VEGF對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用的影響*

阮瓊芳， 趙超莉， 葉子青， 謝瓊慧， 謝衛(wèi)國(guó)△

(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院暨武漢市第三醫(yī)院燒傷研究所，湖北 武漢 430060)

目的： 觀察電燒傷大鼠血清誘導(dǎo)的單核細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的水平，探討其對(duì)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用的影響。方法: 制做電燒傷大鼠模型，制備電燒傷大鼠血清，同時(shí)制備正常大鼠血清作為對(duì)照。采用夾心ELISA法檢測(cè)正常大鼠血清和電燒傷大鼠血清中VEGF及其可溶性受體sFlt-1含量。按照隨機(jī)數(shù)字表法將人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞分為正常血清組和電燒傷血清組，ELISA法檢測(cè)2組細(xì)胞上清液中VEGF和sFlt-1含量。按照隨機(jī)數(shù)字表法將人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞分為正常血清組、燒傷血清組、正常血清+阻斷劑組和燒傷血清+阻斷劑組。取培養(yǎng)3 h、6 h的THP-1細(xì)胞，加入單層血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926細(xì)胞，行單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附檢測(cè)。結(jié)果: 大鼠電燒傷后血清VEGF水平較正常大鼠顯著增加， sFlt-1水平較正常大鼠明顯減少。電燒傷血清誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌VEGF，sFlt-1水平隨之減少。電燒傷血清可促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，sFlt-1可抑制電燒傷血清誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用。結(jié)論: 電燒傷大鼠血清誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌VEGF,從而促進(jìn)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附。阻斷VEGF的生物學(xué)效應(yīng)，可有效抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。

電燒傷； 單核細(xì)胞； 內(nèi)皮細(xì)胞； 黏附作用

過(guò)度炎癥反應(yīng)是電燒傷重要的病理生理學(xué)改變之一，它是導(dǎo)致和加劇傷后組織進(jìn)行性壞死的重要原因。單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附是血管炎癥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此，闡明單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用的機(jī)制對(duì)電燒傷早期過(guò)度炎癥反應(yīng)的控制具有重要意義。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又稱血管通透因子(vascular permeabi-lity factor，VPF)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的增強(qiáng)血管通透性的物質(zhì)之一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)電燒傷早期大量炎癥細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均高表達(dá)VEGF[1]，我們推測(cè)VEGF在電燒傷早期血管炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究擬采用電燒傷大鼠血清培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，初步探討單核細(xì)胞分泌VEGF對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 材料與試劑 DMEM培養(yǎng)液、RPMI- 1640培養(yǎng)液和FBS購(gòu)自Gibco；大鼠VEGF、大鼠VEGF可溶性受體sFlt-1、人VEGF和人sFlt-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein-AM)購(gòu)自Sigma；sFlt-1購(gòu)自R&D。

1.2 細(xì)胞 人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，人血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 血清制備 參照文獻(xiàn)[2]方法制作電燒傷模型。電燒傷組大鼠以30 g/L戊巴比妥鈉按10 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在大鼠臀部及右后肢備皮，小電極置于右踝上0.5 cm小腿腹側(cè)皮膚上，大電極置于同側(cè)臀肌處。致傷電壓1 kV，電擊時(shí)間0.1 s，創(chuàng)面面積為0.5 cm×0.5 cm、深達(dá)骨骼，無(wú)低血容量性休克發(fā)生。于電燒傷后1 d處死，取外周靜脈血靜置 1 h，1 000×g離心10 min，分離血清，即為電燒傷大鼠血清。正常大鼠不作處理，直接取外周靜脈血，余處理同前，即為正常大鼠血清。電燒傷血清和大鼠血清均于56 ℃滅活30 min，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將THP-1細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取部分THP-1細(xì)胞，PBS清洗2次，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常血清組：將細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)20%正常大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中；電燒傷血清組：將細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中；細(xì)胞濃度均調(diào)至1×109/L。加入6孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔2 mL，常規(guī)條件培養(yǎng)。

2.3 ELISA檢測(cè)大鼠血清和THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和sFlt-1的含量 采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定大鼠血清和THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和sFlt-1的含量，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2.4 sFlt-1抑制VEGF生物學(xué)活性對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用影響的實(shí)驗(yàn)分組及處理 另取部分THP-1細(xì)胞，PBS清洗2次，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為(1)正常血清組：采用含體積分?jǐn)?shù)20%正常大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)電燒傷血清組：采用含體積分?jǐn)?shù)20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；(3)正常血清+阻斷劑組：用含100 μg/L sFlt-1和20%正常大鼠血清的RPMI- 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；(4)電燒傷血清+阻斷劑組：用含100 μg/L sFlt-1和20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L，加入6孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔2 mL，置于常規(guī)條件培養(yǎng)。

2.5 單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附檢測(cè) 將EA.hy926細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，擴(kuò)增細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用DMEM培養(yǎng)液將EA.hy926細(xì)胞濃度調(diào)至1×108/L，加入96孔板，每孔0.2 mL，待細(xì)胞完全融合至單層備用。取經(jīng)上述2.4步驟處理的培養(yǎng)3 h、6 h的THP-1細(xì)胞，用calcein-AM進(jìn)行標(biāo)記，D-Hanks平衡液洗滌2次，采用RPMI- 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至5×108/L備用。用D-Hanks平衡液洗滌96孔板中鋪有EA.hy926細(xì)胞的培養(yǎng)孔2次，每孔加入0.2 mL的THP-1細(xì)胞，37 ℃孵育30 min，用D-Hanks平衡液小心沖洗掉未黏附的THP-1細(xì)胞。置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野，取平均值計(jì)算黏附的THP-1細(xì)胞數(shù)目。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 電燒傷大鼠血清VEGF和sFlt-1含量

大鼠電燒傷后6 h和24 h血清VEGF的水平較正常大鼠顯著增加(P<0.01), 血清sFlt-1的水平較正常大鼠明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 電燒傷大鼠血清VEGF和sFlt-1的含量

Table 1.VEGF and sFlt-1 concentrations in the serum of rats with electrical burns (Mean±SD.n= 6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(μg/L)Normal 55.40±5.193.10±0.16Electricalburn(6h)85.80±6.69**2.50±0.16**Electricalburn(24h)164.20±10.61**1.20±0.02**

**P<0.01vsnormal.

2 THP-1細(xì)胞上清VEGF和sFlt-1的含量

電燒傷血清組培養(yǎng)3 h、6 h和24 h，THP-1細(xì)胞上清中的VEGF水平較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；細(xì)胞上清中sFlt-1的水平較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 電燒傷血清培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞上清VEGF和sFlt-1的含量

Table 2.VEGF and sFlt-1 concentrations in supernatants of THP-1 cells cultured with electrical burn serum (Mean±SD.n=6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(ng/L)Normalserum 129.90±5.02498.00±8.26Electrical3h193.30±7.20**455.90±6.66** burnserum6h274.40±6.36**432.20±5.27** 24h406.20±7.91**392.00±4.58**

**P<0.01vsnormal serum.

3 單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附

與正常血清組比較，電燒傷血清組每100倍視野下與EA.hy926細(xì)胞黏附的THP-1細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P<0.01)；而電燒傷血清+阻斷劑組每100倍視野下與EA.hy926細(xì)胞黏附的THP-1細(xì)胞數(shù)較電燒傷血清組明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of sFlt-1 on monocyte adhesion cultur with electrical burn serum (×100) . A, E: normal serum; B, F: normal serum+sFlt-1; C, G: electrical burn serum; D, H: electrical burn serum+sFlt-1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal serum.

圖1 sFlt-1對(duì)電燒傷血清誘導(dǎo)單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用的影響

討 論

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，其表達(dá)可受多個(gè)因素調(diào)節(jié)，其中，缺氧是最強(qiáng)的刺激因子[3]。VEGF可與血管內(nèi)皮細(xì)胞上酪氨酸激酶受體(VEGFR1和VEGFR2)的細(xì)胞外結(jié)合域結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。不同受體各有其不同生物學(xué)作用，例如VEGFR1對(duì)單核和巨噬細(xì)胞的游走有正調(diào)節(jié)作用，而對(duì)VEGFR2的信號(hào)傳遞起著正(負(fù))調(diào)控作用，可溶性VEGFR1(sFlt-1)具有與VEGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)，能與VEGF結(jié)合，阻斷VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是內(nèi)源性直接靶向VEGF的阻斷劑[4-5]。

本研究首先觀察電燒傷后大鼠血清VEGF和sFlt-1的水平，結(jié)果顯示傷后6 h和24 h大鼠血清VEGF的含量較正常大鼠明顯增加，血清sFlt-1的含量反之下降。我們推測(cè)電燒傷后受傷肢體高度腫脹，組織間壓力增高，血管受壓導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，可能是電燒傷后血清VEGF水平升高的重要原因；傷后sFlt-1的水平下降亦可是導(dǎo)致有生物活性的VEGF的釋放量增多的另一個(gè)重要因素。

電燒傷血清是電燒傷導(dǎo)致機(jī)體病理生理改變的綜合體液因素，含氧自由基、炎癥介質(zhì)和多種細(xì)胞因子，是引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要因素。本研究體外實(shí)驗(yàn)中，我們采用電燒傷血清培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1模擬體內(nèi)微環(huán)境對(duì)單核細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，電燒傷血清組培養(yǎng)3 h、6 h、24 h THP-1細(xì)胞上清液中的VEGF含量隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加且均明顯高于正常對(duì)照組；sFlt-1的變化則相反，其含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。這一變化結(jié)果與傷后大鼠血清VEGF和sFlt-1的改變相同。以上結(jié)果提示，VEGF含量增加與sFlt-1的減少密切相關(guān)。

我們前期研究結(jié)果顯示，電燒傷血清可以促進(jìn)單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用[6]。為了進(jìn)一步證實(shí)單核細(xì)胞分泌VEGF參與了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，筆者采用sFlt-1與電燒傷血清共孵育THP-1細(xì)胞，電燒傷血清+sFlt-1組與電燒傷血清組比較，結(jié)果顯示sFlt-1可有效抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減少與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的單核細(xì)胞數(shù)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)電燒傷早期單核細(xì)胞分泌VEGF可促進(jìn)單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，是血管炎癥反應(yīng)的重要始動(dòng)因素之一；阻斷VEGF生物學(xué)效應(yīng)可有效抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，為電燒傷早期抗炎治療提供新的治療思路和靶點(diǎn)。

[1] 阮瓊芳，謝衛(wèi)國(guó)，溫豐平. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在電燒傷大鼠血清及創(chuàng)面組織中的表達(dá)變化[J]. 中華燒傷雜志，2012，28(6):423-427.

[2] 張 偉，謝衛(wèi)國(guó)，趙超莉，等. 大鼠單側(cè)肢體高壓電擊傷模型的建立[J/CD]. 中華損傷與修復(fù)雜志：電子版，2008，3(4):426-432.

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Effect of monocyte-secreted VEGF induced by electrical burn serum on monocyte-endothelial cell adhesion

RUAN Qiong-fang, ZHAO Chao-li, YE Zi-qing, XIE Qiong-hui, XIE Wei-guo

(InstitureofBurns,WuhanThirdHospitalandTongrenHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:wgxie@hotmail.com)

AIM: To observe the level of vascular endothelial growth factor (VEGF) secreted by monocytes cultured with electrical burn serum, and to explore the effect of VEGF on monocyte-endothelial cell adhesion. METHODS: The electrical burn serum of the rat was prepared. The normal serum from the rats without treating electric current was also collected for control. The contents of VEGF and its soluble receptor sFlt-1 in electrical burn group were determined by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were randomly divided into normal serum group and electrical burn serum group. The contents of VEGF and sFlt-1 in the culture supernatants were measured by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were also randomly divided into another 4 groups: normal serum group, electrical burn serum group, normal serum + inhibitor group and electrical burn serum + inhibitor group. THP-1 cells, which were incubated with the serum for 3 h and 6 h, were labeled with calcein-AM and then were added into the well with monolayer of endothelial cell line EA.hy926 to detect monocyte-endothelial cell adhesion. RESULTS: The levels of serum VEGF of the rats with electrical burns were significantly increased, the levels of serum sFlt-1 were significantly decreased as compared with the controls. The levels of VEGF secreted by THP-1 cells cultured with electrical burn serum were significantly increased, the levels of sFlt-1 were decreased correspondingly. Electrical burn serum enhanced monocyte- endothelial cell adhesion, sFlt-1 inhibited the adhesion between monocytes and endothelial cells. CONCLUSION: The monocytes exposed to the electrical burn serum secrete VEGF, which enhance the adhesion between monocytes and endothelial cells. Blockage of VEGF activity may effectively inhibit monocyte-endothelial cell adhesion.

Electrical burns; Monocytes; Endothelial cells; Adhesion

1000- 4718(2015)04- 0755- 04

2014- 11- 13

2014- 12- 15

武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No. WX13A09); 武漢市科技局重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(No. 20056007071)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.032

△通訊作者 Tel: 027-68894838; E-mail: wgxie@hotmail.com