趙志偉 申貴雋谷靈燕

（大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連116622）

DL-賴氨酸－β－環(huán)糊精/碳納米管修飾電極的制備與應(yīng)用研究

趙志偉 申貴雋＊谷靈燕

（大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連116622）

對DL-賴氨酸－β－環(huán)糊精/碳納米管修飾金電極的制備與應(yīng)用進(jìn)行了研究，建立了一種新的測定DL-賴氨酸的電化學(xué)分析方法。用循環(huán)伏安法研究了該修飾電極的選擇性和靈敏度以及DL-賴氨酸在修飾電極上的氧化還原特性，結(jié)果表明該修飾電極對DL-賴氨酸具有顯著的催化還原和選擇作用。在pH＝5.6的磷酸鹽緩沖溶液中，還原峰電流與DL-賴氨酸濃度在5～100mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.1mg/L。方法操作簡便，可用于藥劑中DL-賴氨酸含量的測定。

β－環(huán)糊精；多壁碳納米管；修飾電極；DL-賴氨酸

0 前言

賴氨酸（Lysine）是人體必需氨基酸之一，在食物中含量甚低，加工過程中極易破壞，又不能在體內(nèi)合成，但是它不僅是合成體內(nèi)蛋白不可缺少的成分，而且還參與體內(nèi)的能量代謝等過程，因此廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥工業(yè)。

目前，測定賴氨酸的方法有DBL法［1］、茚三酮比色法［2］、近紅外光譜分析法［3］、FDNB法［4］、胍基反應(yīng)法［5］、熒光分析法［6］、染料法［7］、分光光度法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］等，但是這些方法大多涉及貴重的儀器和復(fù)雜的操作，并且靈敏度不高，使用受到限制，而電化學(xué)方法操作簡單，快速，成本低廉，并且能夠克服這些缺點(diǎn)，可以被應(yīng)用于賴氨酸的測定。但是，未修飾的電極對賴氨酸的選擇性和靈敏度差，并且反應(yīng)緩慢［10］，因此，通過電聚合的方法將具有空腔結(jié)構(gòu)的β－環(huán)糊精［11－12］和DL－賴氨酸共同修飾于電極表面，然后把具有導(dǎo)電催化效應(yīng)的羧基化多壁碳納米微管滴涂到電極表面，定量測定藥劑中的賴氨酸含量。這種修飾電極制作簡單，并有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，測定結(jié)果較為理想，與未修飾的金電極相比較，它具有選擇性好、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CHI600C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統(tǒng)：金電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有公司）或修飾電極為工作電極，參比電極為飽和甘汞電極（天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司），對電極為鉑電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心沉淀機(jī)80-1型（上海機(jī)械手術(shù)廠）；pHB-1型酸度計(jì)（上海宇隆儀器有限公司）；FA1604型分析天平（上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司）。

多壁碳納米管（純度＞95%，Φ8～15nm，中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所）；β－環(huán)糊精（天津市盛銘寶商貿(mào)有限公司）；DL-賴氨酸（中國惠興生化有限公司）；磷酸二氫鈉－磷酸氫二鈉（PBS緩沖溶液，自制）。賴氨肌醇維B口服溶液（濟(jì)川藥業(yè)股份有限公司）；所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 修飾電極的制備

1.2.1 金電極預(yù)處理

將金電極在金相砂紙上打磨，然后在麂皮墊上依次用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3粉末拋光，依次用無水乙醇和水充分超聲清洗。將處理后的電極置于1.0mol/L的H2SO4溶液中，以50mV/s掃描速度，在－0.2～＋1.6V電位區(qū)間用循環(huán)伏安法（CV）掃描直至穩(wěn)定［13］。將電極取出后用去離子水沖洗干凈，然后將清洗完畢的電極保存在去離子水中備用。

1.2.2 DL-賴氨酸－β－環(huán)糊精/多壁碳納米管修飾電極的制備

將5mLβ-CD（5×10－3mol/L），5mL DL-lys（100mg/L）和5mL H2SO4（0.5mol/L）混合到一起超聲反應(yīng)15min，然后以金電極為基體電極，在此介質(zhì)中，溶液靜置條件下。以100mV/s的掃描速度，－0.6～1.0V電位范圍之間，通過循環(huán)伏安法掃描20圈至CV曲線穩(wěn)定，然后取出電極，經(jīng)去離子水淋洗電極表面，在紅外燈下干燥。

采用V（HNO3）∶V（HCl）＝1∶3回流12h的方法將MWNTs羧基化，用NaOH（0.01mol/L）洗至pH值為近中性時(shí)止，離心后干燥。稱取5.0mg預(yù)處理過的MWNTs于5.0mL DMF（N，N-二甲基甲酰胺）中超聲分散30min，最后得到穩(wěn)定的黑色分散液。取適量滴在DL－賴氨酸－β－環(huán)糊精修飾電極的表面，紅外燈下烘干即制得DL-lys-β-CD/MWNTs修飾電極，放在PBS緩沖溶液中保存，待用。

1.2.3 對比修飾電極制備

將5mL DL－賴氨酸（100mg/L），5mL去離子水和5mL H2SO4（0.5mol/L）混合到一起超聲反應(yīng)15min，其它實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.2，即得到DL-lys/MWNTs修飾電極；將5mLβ-CD（5×10－3mol/L），5mL去離子水和5mL H2SO4（0.5mol/L）混合到一起超聲反應(yīng)15min，其它實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.2，即得到β-CD/MWNTs修飾電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 電聚合膜的循環(huán)伏安法表征

以為探針分子，分別測定了裸金電極，β-CD/MWNTs修飾電極，DL-Lys/MWNTs修飾電極、MWNTs修飾電極，DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極的循環(huán)伏安圖（圖1）。圖1中，K3［Fe（CN）6］探針分子在裸金電極上的氧化峰與還原峰對稱性良好，具有良好的可逆性，而在DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極（曲線e）上的氧化峰正移，峰型變寬，峰電流顯著減小，甚至還原峰消失，探針分子在修飾電極上的可逆性嚴(yán)重減弱。可能由于修飾電極表面β-CD和氨基酸形成的包絡(luò)物分子含-COOR基團(tuán)，具有較高的負(fù)電荷密度，因此這種靜電排斥抵制鐵氰化鉀到達(dá)修飾電極的表面，從而阻止其在電極表面的電子傳遞。這表明，DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極表面的電活性物質(zhì)增加［11］，電極表面已經(jīng)形成了一定覆蓋率的膜層，抑制了K3［Fe（CN）6］探針分子向金電極表面的擴(kuò)散，可以證明電極的修飾結(jié)果較好［14－15］。此外，曲線e與b，c，d相比較，曲線b，c，d三者幾乎相同，并且與曲線a的峰電流相差不大，這說明只有DL-Lys，β-CD和MWNTs共同修飾于金電極表面時(shí)，才會有較好的修飾效果。

圖1 不同電極在鐵氰化鉀中的循環(huán)伏安響應(yīng)曲線Figure 1 Cyclic voltammograms of different electrodes in Potassium ferricyanide solution.

2.2 DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極的電化學(xué)性能2.2.1 靈敏度

將裸金電極和不同的修飾電極，以50mV/s的掃描速度，在－0.8～1.0V電位范圍之間，用循環(huán)伏安法掃描20mg/L的DL-lys，結(jié)果如圖2所示。圖3為DL-lys在修飾電極表面可能發(fā)生的氧化還原反應(yīng)。圖2中，該修飾電極的氧化峰電流很小，是由于在酸性介質(zhì)中H＋對DL-lys的氧化反應(yīng)起到了抑制作用，金電極優(yōu)先失去了電子［16］；還原峰產(chǎn)生較大的峰電流是因?yàn)镈L-lys在電極表面發(fā)生了加氫的還原反應(yīng)，生成了醛基化合物。同時(shí)，DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極的峰電流的絕對值最大，較裸金電極高出兩個(gè)數(shù)量級，較其它修飾電極高出兩倍左右，說明該修飾電極具有較好的靈敏度。此外，與曲線a相比，曲線b，c，d相差不多，表明該修飾電極靈敏度提高是由于DL-Lys和β-CD的共同作用，而不是因?yàn)镈L-lys和β-CD的單獨(dú)作用或電極在酸性介質(zhì)中循環(huán)掃描活化的影響。

圖2 不同修飾電極在DL－賴氨酸中的循環(huán)伏安圖Figure 2 Cyclic voltammograms of different modified electrodes in DL-lysine solution.

2.2.2 選擇性

以DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極，分別在PBS緩沖底液、DL-賴氨酸（20mg/L）、L-色氨酸、DL苯丙氨酸和DL－谷氨酸介質(zhì)中，以50mV/s的掃速，在－0.6～1.0V電位范圍內(nèi)用循環(huán)伏安法掃描，結(jié)果如圖4所示。圖4中，與緩沖溶液峰電流相近的依次是DL－谷氨酸，DL-苯丙氨酸，L-色氨酸和DL-賴氨酸，同時(shí)，賴氨酸與其它氨基酸的峰電位相差0.08V左右。氨基酸的峰電流與緩沖溶液越接近，表明修飾電極對該種氨基酸的響應(yīng)值越差，并且它們之間的峰電位有明顯的區(qū)別，證明了DL-Lysβ-CD/MWNTs修飾電極對DL-賴氨酸具有良好的選擇性。

圖3 DL-lys在修飾電極上的化學(xué)反應(yīng)Figure 3 Chemical reactions of DL-lys on the modified electrodes.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

在pH＝4.8～6.4范圍內(nèi)改變底液的pH值，測定DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極上20mg/L的DL-lys的峰電流。DL-lys的還原峰電流絕對值大小在pH＝4.8～6.4范圍內(nèi)先增大后減小，在pH＝5.6時(shí)達(dá)到最大，故選擇pH＝5.6的PBS為最佳底液。在20～160mV/s范圍內(nèi)改變掃描速率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，100mV/s時(shí)峰電流的絕對值最大，故實(shí)驗(yàn)選擇100mV/s的掃描速率。用DL-Lys和β-CD修飾電極，掃描次數(shù)為20時(shí)，峰電流的絕對值最大，故選擇實(shí)驗(yàn)的最佳掃描次數(shù)為20次。

圖4 修飾電極在不同氨基酸中的循環(huán)伏安圖Figure 4 The cyclic voltammogram of modified electrode in the different amino acids solutions.

2.4 工作曲線、重線性和穩(wěn)定性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法對不同濃度的DL－賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了定量測定，濃度在5～100mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系為I（μA）＝0.734 2C－335.08，相關(guān)系數(shù)Y＝0.966 8，最低檢出限為0.1mg/L，如圖5所示。圖5中，峰電位隨著DL-lys濃度的增加而增大，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與能斯特方程反映的規(guī)律完全一致。

用DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極對20mg/L的DL-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定10次，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.5%，說明該修飾電極重現(xiàn)性良好。

DL-Lys-β-CD/MWNTs修飾電極在室溫、空氣流通的條件下保存14d，對DL-lys標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)電流基本不變，說明該電極具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 樣品分析及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對賴氨肌醇維b12口服液經(jīng)稀釋處理后得到50mg/L的樣品溶液，用修飾好的電極連續(xù)測定3次，并在樣品中加入DL-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該修飾電極對DL-賴氨酸的測定，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

圖5 DL-lys標(biāo)準(zhǔn)溶液的循環(huán)伏安圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 The cyclic voltammograms of DL-lys standard solutions and standard curve.

表1 樣品測定及回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Determination of the sample and results of recovery test /（mg·L－1）

3 結(jié)論

論文研究了DL－賴氨酸在DL－賴氨酸－β－環(huán)糊精/碳納米管修飾電極上的電化學(xué)行為。由于環(huán)糊精與DL－賴氨酸之間強(qiáng)烈的相互作用，共同修飾于電極表面后，增加了對DL-賴氨酸的響應(yīng)，而且多壁碳納米管具有大的比表面積以及較多的活性位點(diǎn)，能夠提高DL-賴氨酸檢測的靈敏度，使得DL-賴氨酸在DL-lys-β-CD/MWNTs修飾金電極上顯示了很好的氧化還原活性。修飾電極具有選擇性好、靈敏度高、電化學(xué)穩(wěn)定性好和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出優(yōu)越的導(dǎo)電性能。該修飾電極可用于測定藥劑中的DL－賴氨酸，并將具有較好的應(yīng)用前景。

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Preparation and Application of DL-lysine-β-cyclodextrin/Carbon Nanotube Modified Electrode

ZHAO Zhiwei，SHEN Guijun＊，GU Lingyan
（College of Environmental and Chemical Engineering，Dalian University，Dalian，Liaoning116622，China）

A DL-lysine-β-cyclodextrin/carbon nanotube modified gold electrode was prepared and its application was studied.Based on this，a new electrochemical analysis method was developed for the determination of DL-lysine.The selectivity and sensitivity of the modified electrodes and the oxidation reduction properties of DL-lysine on the modified electrodes were investigated by cyclic voltammetry.The results showed that the modified electrodes exhibited significant catalytic reduction and selectivity for DL-lysine.A good linear relationship between the reductive peak current and the concentration of DL-lysine in the range of 5～100mg/L was obtained in phosphate buffer solution with pH＝5.6，and the detection limit was 0.1mg/L.The method is simple and can be used for the determination of DL-lysine content in medicament.

β-cyclodextrin；multiwall carbon nanotubes；modified electrode；DL-lysine

O657.1；TH832

：A

：2095-1035（2015）01-0070-05

2014-09-24

：2014-11-13

大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012E15-8F169）資助

趙志偉，男，學(xué)生。E-mail：18042656813＠163.com

＊通信作者：申貴雋，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事電分析化學(xué)分析方面研究。E-mail：sgj0501＠163.com

10.3969/j.issn.2095-1035.2015.01.020