詹 成（綜述） 燕 麗王 琳金玉麟陳 力時(shí) 雨△（審校） 王 群

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科 上海 200031）

數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用

詹 成1（綜述） 燕 麗2王 琳1金玉麟1陳 力1時(shí) 雨1△（審校） 王 群1

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科 上海 200031）

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)作為一種全新的核酸檢測(cè)方法，通過把反應(yīng)體系均分到大量反應(yīng)單元中獨(dú)立地進(jìn)行PCR，并根據(jù)泊松分布和陽(yáng)性比例來計(jì)算核酸數(shù)量。目前dPCR主要分為微滴式和芯片式兩種。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，dPCR具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)。因此，dPCR技術(shù)在近年來得到了迅速的發(fā)展，廣泛地應(yīng)用于稀有突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異分析和復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)等方面。

數(shù)字PCR； 微滴式dPCR； 芯片式dPCR； 突變檢測(cè)； 拷貝數(shù)變異； 基因表達(dá)

【Abstraet】 As a new detection technology for the quantification of nucleic acid，the digital PCR （dDCR）divides reaction mixes into a large number of units，carries out PCR independently in each units，and then calculates the number of nucleic acidsaccording to Poisson distribution and positive ratio.At present，dPCR can be divided into two major kinds：droplet dPCR and chip dPCR.dPCR has the advantages of higher sensitivity，higherprecision，highertolerance and absolute quantification when compared with the traditional PCR technology.Therefore，dPCR technology has been rapidly developing in recent years，and widely applied to the detection of rare mutations，copy number variation analysis and gene expression detection in complicated samples.

【Kcy words】 digital PCR； droplet dPCR； chip dPCR； mutation detection； copy number variation； gene expression

自從PCR技術(shù)在20世紀(jì)80年代被發(fā)明以來，這一方法已經(jīng)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最基礎(chǔ)和最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法之一。第一代傳統(tǒng)的PCR技術(shù)采用瓊脂糖凝膠電泳的方法來對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但這一方法主要適用于定性和半定量研究。在20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)了第二代的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技術(shù)，通過在反應(yīng)體系中加入熒光染料，檢測(cè)反應(yīng)中發(fā)出的熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)即循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）來計(jì)算目的酸序列的含量。qPCR技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)易和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，目前仍被各實(shí)驗(yàn)室廣泛地使用。但qPCR技術(shù)所謂的“定量”仍然是相對(duì)的，依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線。qPCR在目的序列含量低、表達(dá)量差異十分微小、反應(yīng)體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。在這種背景下，第三代PCR——數(shù)字PCR（digital PCR，d PCR）應(yīng)運(yùn)而生了。

d PCR技術(shù)的原理dPCR的原理并不復(fù)雜。首先，dPCR把反應(yīng)體系均勻分配到大量反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中不包含或包含一個(gè)到多個(gè)目的核酸序列，目的核酸序列的數(shù)量符合泊松分布。然后在每個(gè)反應(yīng)單元中獨(dú)立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布和熒光信號(hào)陽(yáng)性的反應(yīng)單元占所有反應(yīng)單元的比例來計(jì)算目的核酸序列的拷貝數(shù)。在d PCR反應(yīng)中熒光信號(hào)的產(chǎn)生過程基本與qPCR相同。

d PCR技術(shù)的發(fā)展早在1992年，在qPCR技術(shù)成熟之前，Sykes等［1］使用有限稀釋（limiting dilution）、PCR和泊松分布模型的方法，檢測(cè)了復(fù)雜背景下低豐度的Ig H重鏈突變基因，進(jìn)行了極其精細(xì)的定量研究，靈敏度可達(dá)2/160 000。雖然當(dāng)時(shí)并未明確稱這一方法為“數(shù)字PCR”，但此研究已經(jīng)奠定了d PCR的雛形，并且明確了dPCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則，即以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無”（allor-none end point）作為定量方法，這也是后來這一方法被命名為d PCR的主要原因［2］。1999年，Vogelstein等［3］首次正式提出了dPCR的概念，他們?cè)诮Y(jié)腸癌患者糞便中檢測(cè)KRAS基因突變時(shí)，首先把樣本分配到384孔板中，然后分別用不同熒光檢測(cè)突變基因和正?；?，通過計(jì)算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。

雖然d PCR技術(shù)的原理并不復(fù)雜，然而早期在第一步的樣品分配的環(huán)節(jié)上卻遇到了難以突破的困難，在分配的數(shù)量和均勻性上都很難達(dá)到要求，這一困難極大地限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。直到近幾年來，隨著油包水乳化微滴、集成微流體通路（integrated fluidic circuit，IFC）、納米制造等技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，dPCR技術(shù)終于突破了技術(shù)瓶頸，成功地實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。

目前商業(yè)化的dPCR技術(shù)可以分成兩大類：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR （chip d PCR，cd PCR）技術(shù)。dd PCR技術(shù)以Biorad公司的QX200系統(tǒng)以及Raindance Technologies公司的RainDrop為代表，其原理是把每個(gè)樣本的反應(yīng)液均勻分割成2萬個(gè)（QX200）或100個(gè)～1 000萬個(gè)（RainDrop）乳液包裹的微液滴，在每個(gè)微滴內(nèi)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然后dd PCR通過類似于流式細(xì)胞技術(shù)的方法逐個(gè)對(duì)液滴的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算含目標(biāo)熒光的液滴占所有液滴的比例來檢測(cè)目的序列的含量。cdPCR技術(shù)以Fluidigm公司的Bio Mark HD系統(tǒng)以及Life Techonology公司的QuantStudio 3D系統(tǒng)為代表，在這一技術(shù)中，反應(yīng)液通過微流控等技術(shù)被均勻?qū)胄酒系姆磻?yīng)倉(cāng)或通孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個(gè)反應(yīng)倉(cāng)或者通孔的熒光信號(hào)，進(jìn)而計(jì)算目的序列的含量。目前，每張芯片上集成有相互獨(dú)立的1萬～4萬個(gè)（Bio Mark HD）反應(yīng)倉(cāng)或者2萬個(gè)（QuantStudio 3D）通孔。

dPCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用d PCR技術(shù)較qPCR技術(shù)有著以下的優(yōu)勢(shì)：（1）高靈敏度。dPCR本質(zhì)上將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)變成了數(shù)萬個(gè)PCR反應(yīng)，在這數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中分別獨(dú)立檢測(cè)目的序列，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度。（2）高精確度。dPCR通過計(jì)算在數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)量和比例，可以精確地檢測(cè)出變化很小的目的序列差異。（3）高耐受性。dPCR技術(shù)第一步反應(yīng)體系分配的過程，可以使背景序列和PCR反應(yīng)抑制物被均勻分配到每個(gè)反應(yīng)單元，而大部分反應(yīng)單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對(duì)富集于某些反應(yīng)單元中，從而顯著地降低了這些反應(yīng)單元中背景序列和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾。另外，dPCR在對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷陽(yáng)性/陰性兩種狀態(tài)，不依賴于Ct值，受擴(kuò)增效率的影響大為降低，對(duì)背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。（4）絕對(duì)定量。PCR直接計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)，無需依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。

dPCR的以上優(yōu)點(diǎn)使得dPCR特別適合于以下方面的應(yīng)用：

稀有突變檢測(cè) 在大量野生型基因存在的情況下精準(zhǔn)地檢測(cè)低含量的突變基因是目前的研究難點(diǎn)之一，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變基因的檢測(cè)［4］。而dPCR技術(shù)從背景序列中檢測(cè)低豐度目的序列的能力和高靈敏度的特點(diǎn)使得這一技術(shù)特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。

上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinase inhibitor，TKI）類分子靶向藥物在目前非小細(xì)胞肺癌治療中發(fā)揮著重要作用，但幾乎所有從EGFR-TKI藥物獲益的肺癌患者最終都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，EGFR的T790M突變是這一耐藥性產(chǎn)生的重要原因之一。Isobe等［5］采用dPCR檢測(cè)了肺癌術(shù)后采用EGFR-TKI靶向藥物治療并最終復(fù)發(fā)的患者所切除的原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶活檢樣本以及血清游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）中T790M突變，發(fā)現(xiàn)對(duì)于復(fù)發(fā)灶T790M突變陽(yáng)性和陰性的患者，原發(fā)灶T790M的突變頻率分別為0.78％±0.36％和0.07％±0.09％，血清cf DNA中T790M的突變頻率分別為0.018％±0.023％和0.010％±0. 014％。Reid等［6］采用d PCR研究惡性黑素瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞中BRAF基因V600E和V600K突變，結(jié)果表明dPCR在靈敏度上高于qPCR 200倍，檢測(cè)下限為0.0005％。這些研究結(jié)果表明dPCR在檢測(cè)稀有突變上的巨大優(yōu)勢(shì)和超高的靈敏度。目前已有大量研究采用dPCR從患者血清、細(xì)胞和組織內(nèi)檢測(cè)疾病相關(guān)的稀有突變，為診斷和治療提供了重要的參考［7-10］。

拷貝數(shù)變異分析 拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）研究需要極高的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，而dPCR具有高精確度的特點(diǎn)，通過精確計(jì)定量目標(biāo)基因與參照基因（拷貝數(shù)為1的基因，例如CEP17或RNase P），并計(jì)算它們的比值，從而得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，對(duì)不同拷貝數(shù)的分辨精度遠(yuǎn)高于qPCR和測(cè)序。

Qin等［11］采用dPCR技術(shù)檢測(cè)樣本中的CYP2D6和ERBB2基因CNV，結(jié)果表明dPCR技術(shù)在CNV檢測(cè)上有著很高的分辨率，可以有效地區(qū)分低達(dá)15％的拷貝數(shù)差別（例如區(qū)分拷貝數(shù)為6 和7時(shí)）。而Whale等［12］和Weaver等［13］的研究同樣表明了dPCR技術(shù)在CNV檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，分別可以有效區(qū)分17％和25％的CNV，并且隨著所用的反應(yīng)室數(shù)目的升高其分辨率可以進(jìn)一步提升。Bharuthram等［14］比較了dPCR和qPCR對(duì)CCL4L 1和CCL 4L2基因CNV的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)d PCR的準(zhǔn)確性和重復(fù)性都很高，而qPCR在基因拷貝數(shù)較高時(shí)準(zhǔn)確性明顯下降。Davis等［15］研究腦編碼DUF1220結(jié)構(gòu)域CON2亞型的序列拷貝數(shù)與認(rèn)知能力的關(guān)系時(shí)，采用dPCR技術(shù)驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，研究顯示d PCR可以較好地區(qū)分CON2的編碼序列多達(dá)26～33個(gè)的拷貝數(shù)。

復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè) d PCR在石蠟包埋樣本、血液、糞便、食品、土壤、淤泥、標(biāo)本等樣本的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、病原微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分鑒定及含量分析和環(huán)境生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、動(dòng)物學(xué)等涉及基因表達(dá)的研究中得到了廣泛地應(yīng)用。這些樣本中含有大量PCR反應(yīng)的抑制物，極大地影響了PCR反應(yīng)效率。另外，在某些檢測(cè)中，難以制備測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。d PCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)勢(shì)，使其特別適合于這些復(fù)雜樣本中基因表達(dá)的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

Dingle等［16］系統(tǒng)比較了dPCR和qPCR對(duì)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate sodium salt，SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）、肝素等常見PCR抑制物的耐受程度，結(jié)果表明dPCR對(duì)SDS和肝素的耐受程度遠(yuǎn)高于qPCR。Witwer等［17］在研究動(dòng)物進(jìn)食前后血漿植物來源的miRNA含量變化時(shí)，采用dPCR技術(shù)來避免qPCR特異性低、重復(fù)性差的問題。Morisset等［18］分別采用d PCR和qPCR在玉米種子中檢測(cè)MON810轉(zhuǎn)基因成分，對(duì)比發(fā)現(xiàn)d PCR的靈敏度、重復(fù)性和對(duì)抑制物的耐受性均高于qPCR。Moser等［19］把含胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor 1，IGF1）的腺相關(guān)病毒載體注射入小鼠骨骼肌，隨后采用d PCR檢測(cè)小鼠血中IGF1，發(fā)現(xiàn)dPCR有非常高的靈敏度和重復(fù)性。目前已有大量針對(duì)復(fù)雜樣本基因表達(dá)的研究采用d PCR進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果均體現(xiàn)了dPCR在這方面的優(yōu)勢(shì)［20-26］。

結(jié)語(yǔ)dPCR是一個(gè)擁有巨大潛力的新興技術(shù)，具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在稀有突變檢測(cè)、CNV分析和復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用。dPCR技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步發(fā)展與完善，應(yīng)用范圍也會(huì)大大擴(kuò)展。

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Thc dcvclopmcnt and applieation of digital PCR

ZHAN Cheng1，YAN Li2，WANG Lin1，JIN Yu-lin1，CHEN Li1，SHI Yu1△，WANG Qun1
（1Department of Thoracic Surgery，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；2Department of Radiation Oncology，Eye and ENT Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200031，China）

Q 311

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.017

2015-02-06；編輯：王蔚）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81401875，81472225）；上海市自然科學(xué)基金（14ZR1406000）

△Corresponding author E-mail：shi.yu@zs-hospital.sh.cn

*This work was supportcd by thc National Natural Seicnec Foundation of China（81401875，81472225）and thc Natural Seicnec Foundation of Shanghai，China（14ZR1406000）.