符良斌，廖天安，陳井鑫，胡廣偉

(海南省人民醫(yī)院口腔頜面外科，海南 ?？?570311)

TGF-β1促進(jìn)人舌鱗狀細(xì)胞癌侵襲遷移的研究

符良斌，廖天安，陳井鑫，胡廣偉

(海南省人民醫(yī)院口腔頜面外科，海南 ?？?570311)

目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)能否促進(jìn)人舌鱗狀細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。方法細(xì)胞增殖與活性實(shí)驗(yàn)試劑盒(CCK8)檢測比較不同濃度TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCC9、CAL27之間生長速度的差異；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測比較TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細(xì)胞癌SCC9、CAL27之間的遷移差異；Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細(xì)胞癌SCC9、CAL27侵襲遷移能力的差異。結(jié)果CCK8實(shí)驗(yàn)表明低濃度TGF-β1刺激后SCC9、CAL27細(xì)胞與空白對照組相比活細(xì)胞數(shù)量降低，但高濃度組未明顯影響舌鱗癌細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)均顯示，TGF-β1刺激后SCC9、CAL27細(xì)胞與空白對照組相比較具有更強(qiáng)的侵襲能力，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論低濃度TGF-β1可以抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖，但可以顯著促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)化生長因子β1；舌鱗狀細(xì)胞癌；侵襲遷移

舌鱗狀細(xì)胞癌是最常見的口腔癌，具有極強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，特別是頸部轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存時(shí)間[1-2]。舌鱗癌主要是由鱗狀上皮異常增殖形成癌變，經(jīng)歷從正常黏膜到白斑、原位癌、再到浸潤癌的多階段過程[3]。然而，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是由多種因子相互作用引起的。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，能影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和胞外基質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)而調(diào)控組織的形成和分化[4]。在肺癌、肝癌等研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1及其信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用具有雙重性：在腫瘤最初發(fā)生階段，上皮細(xì)胞對TGF-β1具有高度敏感性，TGF-β1可以抑制細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；但在進(jìn)展期，上皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β1信號通路的某些蛋白發(fā)生改變，細(xì)胞對TGF-β1的抑制作用產(chǎn)生耐受，反而增強(qiáng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力[5-7]。然而，TGF-β1對人舌鱗狀細(xì)胞癌作用的相關(guān)研究較少，本研究就重點(diǎn)研究TGF-β1對人舌癌細(xì)胞株SCC9和CAL27的生長、侵襲遷移能力方面的影響，為進(jìn)一步探討TGF-β1對人舌鱗狀細(xì)胞癌調(diào)控的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑 舌鱗癌細(xì)胞株SCC9、CAL27購自美國菌種保藏中心(ATCC)，SCC9在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CAL27在含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。TGF-β1購自R&D Systems公司，CCK8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所(DOJINDO)，Matrigel膠購自BD生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)BS、DMEM-F12培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司，Transwell小室、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿購自康寧公司(Corning)。

1.2 CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 將人舌鱗癌細(xì)胞接種于96孔板，約5×103個(gè)/孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml不同濃度的TGF-β1，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1～5 d每天按分組去除96孔板每孔中培養(yǎng)液，每孔加入100 μl以新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋5倍的CCK8培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測以610 nm處測量各孔的吸光值。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 將舌鱗癌細(xì)胞種入6孔板，生長至95%左右時(shí)，用10 μl的微量加樣槍頭劃出無細(xì)胞區(qū)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去劃痕后脫落的細(xì)胞，拍攝劃痕區(qū)0 h的圖像，空白對照組以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理組以含5 ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)拍照，直至劃痕區(qū)已填滿，再次拍照觀察細(xì)胞的遷移能力。

1.4 侵襲遷移實(shí)驗(yàn) 將舌鱗癌細(xì)胞胰酶消化處理后細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)Transwell小室上室等量接種約1×105個(gè)細(xì)胞/200 μl無血清培養(yǎng)基，空白對照組下室加無血清培養(yǎng)基500 μl，處理組下室加含5 ng/ml TGF-β1培養(yǎng)基500 μl，37℃恒溫箱培養(yǎng)10 h/SCC9、 24 h/CAL27后，取出小室于4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，擦去小室底膜上層細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)透過膜的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取5個(gè)100倍視野細(xì)胞計(jì)數(shù)并取其均值。進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將50 μl Matrigel加入Transwell小室上室，37℃孵育30 min，然后接種細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為20 h/SCC9、48 h/CAL27，其余同前遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 低濃度TGF-β1抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖 CCK8細(xì)胞活性試驗(yàn)顯示，1～5 d后TGF-β1實(shí)驗(yàn)組與PBS對照組比較，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml濃度TGF-β1組的SCC9在刺激96 h、120 h后活細(xì)胞數(shù)量明顯減少[t(1ng/ml，96h)=4.512，t(1ng/ml，120h)=6.452，t(5ng/ml，96h)= 4.092，t(5ng/ml，120h)=5.636，t(5ng/ml，96h)=4.838，t(5ng/ml，120h)= 5.025，P＜0.01]，而20 ng/ml、30 ng/ml濃度TGF-β1組的SCC9活細(xì)胞數(shù)量并無明顯變化[t(20ng/ml，96h)=0.942，t(20ng/ml，120h)=2.125，t(30ng/ml，96h)=2.392，t(30ng/ml，120h)=3.543，P＞0.05]；同樣，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml濃度TGF-β1組的CAL27在刺激120 h后活細(xì)胞的數(shù)量明顯減少[t(1ng/ml，120h)=5.126，t(5ng/ml，120h)=6.036，t(5ng/ml，120h)=4.954，P＜0.01]，但20 ng/ml、30 ng/ml濃度TGF-β1組活細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[t(20ng/ml，120h)=1.925，t(30ng/ml，120h)= 2.244，P＞0.05]，見圖1，說明較低濃度的TGF-β1抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長，較高濃度的TGF-β1并無明顯影響舌鱗癌細(xì)胞的增殖能力。

2.2 TGF-β1處理的舌鱗癌細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng) 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，24 h后TGF-β1處理組的舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27均可把劃過的痕全部覆蓋，而PBS對照組則有明顯的劃痕，說明TGF-β1處理后舌鱗癌細(xì)胞的遷移能力顯著提高(見圖2)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與PBS對照組的SCC9相比，TGF-β1處理的實(shí)驗(yàn)組SCC9細(xì)胞直接穿過Transwell小室的數(shù)量增加了5.6倍(t=5.042，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿過Transwell小室的數(shù)量增加了6.8倍(t=6.224，P＜0.01)，見圖3；經(jīng)TGF-β1處理的CAL27細(xì)胞直接穿過Transwell小室的數(shù)量增加了5.8倍(t=5.804，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿過Transwell小室的數(shù)量增加了5.2倍(t=4.684，P＜0.01)，見圖3，進(jìn)一步說明TGF-β1處理舌鱗癌細(xì)胞后侵襲、遷移能力顯著增強(qiáng)。

圖1 CCK8檢測不同濃度TGF-β1刺激的舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27比較空白對照組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD比值(aP＜0.05)

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1刺激的舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27的遷移能力

圖3 Transwell檢測TGF-β1刺激的舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27的遷移及侵襲能力(×100)

3 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是由多種因子相互作用后發(fā)生的。已有文獻(xiàn)在乳腺癌、肝癌等多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)，TGF-β1能通過β-整合素信號傳導(dǎo)途徑等多條信號通路對腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)歸發(fā)揮重要作用[8-9]。作為口腔癌中最常見的類型，舌鱗癌的預(yù)后與TGF-β1的關(guān)系也非常密切。研究表明，TGF-β1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)在口腔鱗狀細(xì)胞癌的免疫組化染色中陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，同時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無轉(zhuǎn)移者，說明TGF-β1與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。同時(shí)，蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測TGF-β1刺激或者不刺激Tca8113細(xì)胞后MTA1和E-cadherin的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1上調(diào)MTA1的蛋白和mRNA表達(dá)，下調(diào)E-cadherin表達(dá)水平，也促進(jìn)Tca8113細(xì)胞的侵襲能力，說明TGF-β1信號可以通過MTA1下調(diào)E-cadherin表達(dá)并促進(jìn)舌癌的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。進(jìn)一步成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子受體1(TβR1)的UM-SCC-23細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)，MMP2表達(dá)增高的同時(shí)細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，說明TGF-β/TβR1通路能夠上調(diào)MMP2表達(dá)促進(jìn)頭頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲[12]。結(jié)合我們前面的劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1處理后舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27較空白對照組能更快的覆蓋劃過的痕、穿過Transwell小室。綜上說明，TGF-β1處理后舌鱗癌細(xì)胞侵襲、遷移能力顯著增強(qiáng)，TGF-β1能夠促進(jìn)舌鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

然而增殖實(shí)驗(yàn)卻表明，較低濃度TGF-β1(1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)對舌鱗癌細(xì)胞SCC9、CAL27的生長增殖具有抑制作用，而較高濃度TGF-β1(20 ng/ml、30 ng/ml)并未明顯影響SCC9、CAL27的增殖能力，這也進(jìn)一步解釋了在錯(cuò)綜復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子TGF-β1及其信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的雙重性，一方面低劑量TGF-β1可以抑制舌鱗癌的生長增殖，然而另一方面卻對舌鱗癌的侵襲遷移具有顯著的促進(jìn)作用，說明TGF-β1的作用機(jī)制更多表現(xiàn)在促腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面，這為以后的科學(xué)研究提供重要基礎(chǔ)。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠成功誘導(dǎo)CAL27以及順鉑耐藥細(xì)胞株CAL27-res發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在明顯增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑耐藥性的同時(shí)也抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。這進(jìn)一步說明TGF-β1雖然抑制腫瘤增殖但卻促進(jìn)腫瘤的侵襲遷移，為我們進(jìn)一步探討TGF-β1促進(jìn)舌鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供新的思路。

總之，TGF-β1在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲遷移過程中起著重要作用，可能成為新的抗腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。然而，TGF-β1在促腫瘤侵襲遷移和可能發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換等過程的具體途徑和機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這也為我們下一步的研究提供新的思考。

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Study on TGF-β1in promoting the invasion and metastasis of human tongue squamous cell carcinoma.

FU Liang-bin, LIAO Tian-an,CHEN Jing-xin,HU Guang-wei.
Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the effects of TGF-β1on invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.MethodsCCK8 was used to detect the growth difference of human tongue squamous cell carcinoma lines SCC9 and CAL27,treated with and without different concentration of TGF-β1.Scratch healing and Transwell assay were used to detect the metastasis and invasion difference of SCC9 and CAL27 in presence and absence of TGF-β1.ResultsCCK8 showed that SCC9 and CAL27 treated with lower concentration of TGF-β1had significant reduction than untreated cells,but had no significant difference in higher concentration.Both scratch healing and Transwell assay of SCC9 and CAL27 revealed that TGF-β1-treated SCC9 and CAL27 had greater migration ability than control cells.ConclusionTGF-β1in lower concentration can suppress the proliferation of human tongue squamous cell carcinoma,but also can induce significant invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.

TGF-β1;Tongue squamous cell carcinoma;Invasion and metastasis

R739.86

A

1003—6350（2015）15—2189—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0792

2015-02-05)

符良斌。E-mail：drflb@sina.com