王 坤，張佰忠，易康樂，蔣 雋，王慶橋，李昊幫，燕海峰,*

(1.湖南光大牧業(yè)科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南天心黃雞育種有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410143)

?

雞BCs原代培養(yǎng)貼壁性影響因素分析*

王 坤1,2，張佰忠1，易康樂1,2，蔣 雋2，王慶橋3，李昊幫1，燕海峰1,3*

(1.湖南光大牧業(yè)科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南天心黃雞育種有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410143)

試驗(yàn)從雞第X期胚胎中分離囊胚，使用含10%FBS、青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，對(duì)雞X期BCs進(jìn)行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。分別在6 h、12 h、24 h對(duì)細(xì)胞貼壁性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探究分離方法、離散程度、培養(yǎng)細(xì)胞密度、離心損傷對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：濾紙環(huán)法在分離胚胎上效果最好；細(xì)胞離散程度上，吹打20下效果最好，與吹打30下差異不顯著(P>0.05)，二者與吹打40下差異均顯著(P<0.05)；接種密度上，1×103個(gè)/mL和5×103個(gè)/mL兩組差異不顯著(P>0.05)，這兩組與其它組，以及其它組之間差異均顯著(P<0.05)，密度為1×105個(gè)/mL時(shí)效果最好，5×104個(gè)/mL次之，但密度為5×104個(gè)/mL時(shí)更方便觀察；離心處理上，都離心5 min的條件下，5 590 ×g和1 398 ×g組差異不顯著(P>0.05)，但其與224 ×g處理組差異顯著(P<0.05)，其中5 590 ×g組效果最佳。因此，濾紙環(huán)法分離胚胎，吹打20下離散細(xì)胞，使用5 590 ×g離心5 min，稀釋成5×104個(gè)/mL的密度，接種到96孔板培養(yǎng)，可以獲得較好的結(jié)果。

雞；X期BCs；原代培養(yǎng)；貼壁性

禽類種蛋產(chǎn)出時(shí)，受精卵已發(fā)育成為具有內(nèi)外胚層，總數(shù)達(dá)4萬～6萬個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)(即X期囊胚)[1]，該時(shí)期的細(xì)胞稱為BCs (Blastodermal cells，BCs)。雞BCs在禽類生物技術(shù)研究領(lǐng)域具有十分重要的作用：第一，它是潛在的雞胚胎干細(xì)胞[2]；第二，它是禽類轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中的主要靶細(xì)胞[3-5]；第三，在禽類種質(zhì)資源保護(hù)利用方面，通過解凍BCs制備嵌合體而重新獲得活體[6-8]，解決無法冷凍保存禽類母系(W)遺傳資源的問題。

目前，以上領(lǐng)域的研究與應(yīng)用的技術(shù)瓶頸就是獲得BCs，因此建立高效獲取BCs方法并優(yōu)化其冷凍程序就顯得尤為重要。目前對(duì)囊胚獲取與處理過程缺乏細(xì)致描述，對(duì)BCs活力評(píng)價(jià)還缺乏簡(jiǎn)單實(shí)用方法，尤其是后者，大部分文獻(xiàn)報(bào)道的臺(tái)盼藍(lán)染色法[5-9]，經(jīng)本研究室應(yīng)用證明缺乏實(shí)用性。細(xì)胞培養(yǎng)是研究活組織和活細(xì)胞的良好方法，也是一切細(xì)胞研究的基礎(chǔ)。雞BCs在體外培養(yǎng)時(shí)，一部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并最終分化為不同類型的細(xì)胞，還有一部分細(xì)胞則懸浮聚集分化，形成簡(jiǎn)單的類胚體。所以通過其貼壁生長(zhǎng)的難易程度，可以更加準(zhǔn)確的判定其作為潛在胚胎干細(xì)胞的活力[10]。

本文通過優(yōu)化雞BCs獲取及處理過程中幾個(gè)關(guān)鍵因素，建立一種實(shí)用的BCs貼壁培養(yǎng)方法，為解決BCs活力評(píng)價(jià)方法困境奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)BCs在禽類生物技術(shù)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

白來航雞種蛋，黑絲羽烏雞種蛋，由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所提供。麻林香妃黑土雞種蛋，湖南天心黃雞育種有限公司提供(58周齡左右，種蛋受精率約為96%)。

96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(LabServ，TC處理，聚苯乙烯，無熱源，無菌)，倒置顯微鏡(CK40-F 200，Olympus)，離心機(jī)(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠制造)。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司，配制成含10%FBS、雙抗(青霉素100 UI/mL和鏈霉素100 ug/mL)的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 雞X期囊胚的分離

1)種蛋儲(chǔ)存與消毒

種蛋儲(chǔ)存于10～18 ℃，一般采用10 d內(nèi)的種蛋。用70%酒精擦拭消毒，置于紫外線消毒過的蛋托上，轉(zhuǎn)移到無菌室水平朝上靜置30 min左右，備在超凈工作臺(tái)中，取胚按文獻(xiàn)[2-7]方法進(jìn)行操作。

2)藥勺獲取法按文獻(xiàn)[11]操作

3)改進(jìn)的濾紙環(huán)法

使用內(nèi)孔略大于囊胚的打孔器，制作濾紙環(huán)(內(nèi)外直徑差約為1～2 mm)，滅菌。根據(jù)種蛋大小選取合適培養(yǎng)皿，種蛋保持靜止時(shí)的方位不變，便于囊胚位于正上面，從底部小心敲破蛋殼，兩手從底部破口處，往兩側(cè)迅速掰開，內(nèi)容物快速落入培養(yǎng)皿中，避免蛋殼扎破蛋黃膜。使囊胚位于水平上面，用眼科剪將卵黃膜外囊胚上方的濃蛋清完全剪開，暴露干燥的卵黃膜，用尖嘴小鑷子夾取濾紙環(huán)，孔正對(duì)胚胎，準(zhǔn)確貼在卵黃膜上[2]。沿紙環(huán)外徑邊緣小心將卵黃膜剪開，用鑷子夾住濾紙環(huán)邊緣，在盛有0.9%生理鹽水的幾個(gè)培養(yǎng)皿中輕輕搖動(dòng)，依次漂洗，去除蛋黃及蛋黃膜，直到囊胚從濾紙環(huán)上脫離。

4)發(fā)環(huán)法具體文法按文獻(xiàn)[11-12]操作

1.2.2 BCs的培養(yǎng) 囊胚的撿取與轉(zhuǎn)移：用剪去約3 mm的1 mL Tip吸取脫離蛋黃膜的囊胚，轉(zhuǎn)入含生長(zhǎng)培養(yǎng)基的液滴中，分離到足夠的囊胚(本文每次實(shí)驗(yàn)一般取16個(gè)胚左右)。

囊胚的離散：用上述方法將每次試驗(yàn)所用胚轉(zhuǎn)移到2 mL 離心管中，添加1 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每次吸入1 mL再完全排出，反復(fù)進(jìn)行10～40下，制成不同離散程度的細(xì)胞懸液。

BCs密度調(diào)整：4×104按每個(gè)胚平均值5×104個(gè)估算[1]，通過調(diào)整所添加培養(yǎng)基體積，獲得密度為1×103～1×105個(gè)/mL的不同細(xì)胞懸液。

BCs培養(yǎng)：使用96孔板培養(yǎng)，每孔接種懸液200 uL，在37 ℃、5% CO2濃度與95%相對(duì)濕度的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h半量換液。

1.2.3 不同離散程度對(duì)細(xì)胞貼壁性影響 每次收集16個(gè)胚，按步驟1.2.2描述的細(xì)胞離散方法，分10下、20下、30下與40下4個(gè)批次，進(jìn)行不同離散程度細(xì)胞懸液的培養(yǎng)，每個(gè)批次接種10個(gè)孔，按步驟1.2.2描述的方法培養(yǎng)。

1.2.4 不同細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞貼壁性影響 每次收集8～16個(gè)胚，采用步驟1.2.2描述的方法離散(吹打次數(shù)參考步驟1.2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)論)，按步驟1.2.2描述的方法調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL 、5×103個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL、5×104個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL 5個(gè)批次，每批次接種10個(gè)孔，按步驟1.2.2描述的方法培養(yǎng)。

1.2.5 不同離心轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)細(xì)胞貼壁性影響 實(shí)驗(yàn)收集16個(gè)胚，按步驟1.2.3描述的方法與優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行離散處理。將細(xì)胞懸液分3個(gè)組，分別用224 ×g、1 398 ×g、5 590 ×g離心 5 min，去上清液，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞密度參考步驟1.2.4實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，接種在96孔板，每組接種10個(gè)孔，按步驟1.2.2描述的方法培養(yǎng)。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)的觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 貼壁細(xì)胞呈明顯的集落狀生長(zhǎng)，邊緣清晰，細(xì)胞間隙不明顯，多為梭形或三角性狀，未貼壁細(xì)胞呈散沙狀[13]。

通過兩種參數(shù)估算培養(yǎng)細(xì)胞貼壁率：一是出現(xiàn)貼壁情況的遲早，二是指定時(shí)間出現(xiàn)貼壁情況的孔數(shù)、每孔出現(xiàn)貼壁細(xì)胞的比例(%)。分別在培養(yǎng)6 h、12 h、24 h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況并進(jìn)行記錄。使用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 BCs不同分離方法的比較

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在分離囊胚的方法中，本文改進(jìn)的濾紙環(huán)法最好，易于掌握，(如圖2)，操作成功率達(dá)到80%以上，分離16個(gè)胚平均耗時(shí)1.5 h左右。其它分離方法，盡管可達(dá)到類似分離效果，但操作效率低。藥勺獲取法在漂洗時(shí)比較難操作，容易漂洗不干凈，發(fā)環(huán)法操作復(fù)雜，成功率低。

此外，還發(fā)現(xiàn)：1)種蛋越新鮮，胚的質(zhì)量越好(如圖1)，分離胚就越容易，而且胚也越完整，越易離散。這可能是隨著種蛋儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，水分蒸發(fā)等原因，使囊胚與蛋黃發(fā)生黏連所致；2)濃蛋清剪除要徹底，否則，濾紙環(huán)就不能緊緊吸住卵黃膜從而吸取囊胚，導(dǎo)致漂洗過程中濾紙環(huán)容易脫離，影響囊胚分離質(zhì)量與效率。

圖1 優(yōu)質(zhì)胚的種蛋 圖2 分離后完整的胚盤

Fig.1 Egg with high quality embryo Fig.2 Complete blastoderm separated

2.2 細(xì)胞貼壁性的判斷

不同培養(yǎng)時(shí)間貼壁細(xì)胞所占面積，如圖3，A、B、C、D的貼壁率分別為5%、10%、40%、70%。該方法可以較為精確和直觀的評(píng)定細(xì)胞培養(yǎng)情況，但每次觀測(cè)記錄時(shí)時(shí)間不能太長(zhǎng)，不然會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)效果，也容易造成細(xì)胞的污染。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的貼壁效果圖(250×)

注：A.培養(yǎng)30min；B.培養(yǎng)6h；C.培養(yǎng)12h；D.培養(yǎng)24h

Notes:A. Cells cultured for 30min; B. Cells cultured for 6h; C. Cells cultured for 12h; D. Cells cultured for 24h

2.3 不同離散程度對(duì)細(xì)胞貼壁性影響

由表1可知，分別吹打10、20、30、40次會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果有差異，吹打20次效果最佳，吹打30次差異不顯著(P>0.05)，但與吹打40次差異顯著(P<0.05)。吹打10次時(shí)發(fā)現(xiàn)仍然有較大胚塊的存在，不符合細(xì)胞分散培養(yǎng)的要求，未進(jìn)行貼壁性比較。吹打40次時(shí)，細(xì)胞基本不貼壁，前期極少數(shù)貼壁的細(xì)胞也很快死亡，從顯微鏡中也只能看到呈散沙狀態(tài)。

2.4 不同細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞貼壁的影響

由表2可知，接種細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL與5×103個(gè)/mL時(shí)差異不顯著(P>0.05)，其與其余組，以及其余組之間比較的差異均顯著(P<0.05)。當(dāng)接種密度為1×105個(gè)/mL時(shí)貼壁效果最佳，5×104個(gè)/mL次之。但由于接種密度為1×105個(gè)/mL時(shí)細(xì)胞較多，雖然貼壁快，但視野里細(xì)胞擁擠，不利于觀察。因此建議接種密度為5×104個(gè)/mL為宜，貼壁效果好且視野清晰。當(dāng)接種密度為5×103個(gè)/mL或者更低時(shí)，細(xì)胞的貼壁情況較差，培養(yǎng)6 h后大量細(xì)胞很快死亡。

表1 不同離散程度對(duì)細(xì)胞貼壁性影響

注：同一列中，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，字母不相同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Notes：In the same column，the same superscripts meant no significant difference (P> 0.05)，different superscripts meant significant difference (P< 0.05)，the same as below.

表2 不同細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞貼壁性影響

2.5 不同離心力對(duì)細(xì)胞貼壁的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 398 ×g 和5 590 ×g兩組貼壁情況差異不顯著(P>0.05)，但這兩組與224 ×g離心所得的結(jié)果都有顯著性差異(P<0.05)。5 590 ×g 離心處理的效果最佳，224 ×g離心得到的細(xì)胞貼壁效果最差。

表3 不同離心力處理對(duì)細(xì)胞貼壁性影響

3 討 論

3.1 影響細(xì)胞培養(yǎng)貼壁性因素

本試驗(yàn)著重對(duì)雞X期BCs的無飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)相關(guān)操作進(jìn)行研究，雖然飼養(yǎng)層在BCs的培養(yǎng)過程中起著重要作用，能促進(jìn)BCs的增殖并抑制其分化[14]， 但其本身分泌成分復(fù)雜，而且飼養(yǎng)層細(xì)胞需經(jīng)有絲分裂阻斷劑處理，即使極微量殘留都會(huì)對(duì)BCs產(chǎn)生毒性[15]，給細(xì)胞培養(yǎng)增加了許多不確定因素，難以用于BCs分化分子機(jī)制的研究[16]。非飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系可以減少這些因素的干擾，提高BCs培養(yǎng)的可操作性與可重復(fù)性。

BCs是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞能否貼壁是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵[17]。采用本文的貼壁性判斷方法，通過使用96孔板培養(yǎng)，比以往35 mm培養(yǎng)皿，更容易對(duì)細(xì)胞貼壁性進(jìn)行量化判斷。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)板的質(zhì)量也是關(guān)鍵因素。由于貼壁細(xì)胞需要伸展在培養(yǎng)材料的表面才能增長(zhǎng)，故培養(yǎng)器皿的親水性直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。目前市場(chǎng)上用于培養(yǎng)細(xì)胞的一次性耗材都是由聚苯乙烯注塑成型后，再經(jīng)一些特殊的表面處理(Tissue culture treatment)，使其滿足一些細(xì)胞或組織的貼壁需求。

3.2 囊胚細(xì)胞的分散方法

囊胚的分散主要有酶消化與物理分散方法。酶消化通常采用胰蛋白酶和EDAT混合液處理囊胚，物理方法采用吸管反復(fù)吹打。從保護(hù)細(xì)胞活性角度，物理法更合適，這在家雞胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)上能得到較好結(jié)果[19]。有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為BCs原代培養(yǎng)用物理分散，而傳代培養(yǎng)用酶消化能取得較好效果[13]。本試驗(yàn)采用物理消化法分散細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞離散程度密切關(guān)系到細(xì)胞的貼壁效果，分散的單個(gè)細(xì)胞較難形成新的集落，而多個(gè)細(xì)胞簇則易形成，提示相鄰細(xì)胞間可能存在一定的信號(hào)通路，能互相促進(jìn)生長(zhǎng)[20]。也有報(bào)道顯示，在細(xì)胞生長(zhǎng)外部條件完全相同的情況下，細(xì)胞分散程度不同，會(huì)導(dǎo)致不同的增殖倍數(shù)，影響細(xì)胞產(chǎn)量[21]。

使用物理法對(duì)雞囊胚進(jìn)行吹打離散的效果，顯然與很多因素有關(guān)，如胚的數(shù)目、培養(yǎng)基的體積、每次吹打吸排的體積、Tip頭的種類等，因此本文對(duì)這些條件進(jìn)行了限定，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，還需要根據(jù)本文提供的技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)密度與離心處理

接種密度影響細(xì)胞培養(yǎng)效果，也需隨原代或傳代培養(yǎng)目的不同而進(jìn)行調(diào)整。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種密度是影響細(xì)胞傳代是否成功的重要因素，首次傳代接種密度應(yīng)該大一些，經(jīng)傳代后的細(xì)胞可以適當(dāng)降低接種密度[22]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用96孔板培養(yǎng)時(shí)，接種密度為5×104個(gè)/mL效果最佳，貼壁速率快，視野清楚，可以觀察到貼壁細(xì)胞的形態(tài)特征，也容易對(duì)比出不同時(shí)間段細(xì)胞貼壁的變化。接種密度太大，懸浮細(xì)胞比較多，影響觀察。但有的實(shí)驗(yàn)為了促進(jìn)細(xì)胞增殖，就選用較大的接種密度[23]。如果接種密度太小則可能讓細(xì)胞之間的聯(lián)系不足[20]，導(dǎo)致細(xì)胞貼壁較慢，貼壁效果不好。

離心處理，在一定程度上可以去除卵黃及其它非細(xì)胞雜質(zhì)，也可以用來調(diào)整細(xì)胞密度，但也可能對(duì)細(xì)胞造成一定機(jī)械性損傷[24]。對(duì)比離心與未離心培養(yǎng)組也可以發(fā)現(xiàn)，雖然視野內(nèi)雜質(zhì)較少，但離心處理過的貼壁情況都略差于未離心組，證明離心處理對(duì)細(xì)胞的確存在影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 590 ×g離心5 min效果最好，貼壁率最高，而224 ×g離心得到的細(xì)胞貼壁效果最差，這可能是由于離心速率小，相同時(shí)間(都為5 min)內(nèi)，細(xì)胞沒有沉降下來，最終導(dǎo)致細(xì)胞密度變小，從而影響細(xì)胞貼壁。也有文獻(xiàn)指出，離心時(shí)轉(zhuǎn)速不宜過高，一般規(guī)律是慢速比快速好，變速比勻速好，先慢速后快速更好，不同的轉(zhuǎn)速組合其細(xì)胞產(chǎn)量可相差15%[21]。

采用本文優(yōu)化的條件，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，培養(yǎng)板的價(jià)格每塊6元左右，但培養(yǎng)細(xì)胞起始貼壁時(shí)間提前到了30 min。有文獻(xiàn)報(bào)道BCs早期貼壁時(shí)間為4～6 h[2，25]，也有培養(yǎng)5～6 h后觀察到細(xì)胞趨于聚集[16]，還有培養(yǎng)24 h才出現(xiàn)細(xì)胞集落[11]，但他們使用的培養(yǎng)基成份復(fù)雜，利用了飼養(yǎng)層，甚至有的還采用繁瑣的加蓋片培養(yǎng)方法[2]。本試驗(yàn)在優(yōu)化培養(yǎng)操作技術(shù)的同時(shí)也很好的簡(jiǎn)化了培養(yǎng)條件，降低了培養(yǎng)的難度。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明，使用濾紙環(huán)法分離胚盤，機(jī)械吹打20下離散細(xì)胞，5 590 ×g離心5 min去除雜質(zhì)，然后將細(xì)胞懸液稀釋成5×104個(gè)/mL的密度，接種到96孔板培養(yǎng)，可以獲得較好的結(jié)果。本文所建立的BCs高效獲取及活力檢測(cè)方法，為其在禽類轉(zhuǎn)基因技術(shù)、冷凍保存母系遺傳資源技術(shù)中冷凍損傷評(píng)價(jià)方法等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Factors Affecting the Adherent Rate of Primary Cultured Chicken Blastodermal Cells

WANG Kun1，2，ZHANG Bai-zhong1，YI Kang-le1，2，JIANG Jun2，WANG Qing-qiao3，LI Hao-bang1， YAN Hai-feng1，3*

(1.HunanGuangdaAnimalHusbandryScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Changsha,Hunan, 410131; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HunanAgricultureUniversity,Changsha,Hunan410128; 3.HunanTianxingYellowChickenBreedingCo.,Ltd.,Changsha,Hunan410143)

The chicken blastodermal cells (BCs) were isolated from stage X embryos, and cultured using the high glucose DMEM medium (10% FBS, Penicillin and streptomycin) without feeder layers cells. The cell adherent rate was evaluated at cells cultured for 6h, 12h and 24h,respectively to study the effects of the blastoderm separating, discrete degree, density of cells, and centrifugal force. The results showed that the filter paper ring method worked best on separating the embryo. The discrete degree was the best when blowing 20 times and was not significantly different from that when blowing 30 times (P>0.05), but significant different (P<0.05) when compared with the data in 40-time-beating group. The cells density during culture revealed no significant difference(P>0.05) between the group of 1×103cells/mL and 5×103cells/mL, and significant difference displayed(P<0.05)when compared with other groups and among other groups. The density of 1×105cells / mL reached the best adherent rate, and next was the density of 5×104cells/ mL which was much more convenient to observe with the microscope. Centrifuging for 5 min revealed no significant difference between the group of 5 590 ×g and 1398 Xg(P>0.05), and significant difference displayed when these two groups compared with the group of 224 ×g(P<0.05)and the group of 5 590 ×g performed the best. In conclusion, the best BCs culture procedures was to seperate chicken embryos with filter paper ring,blowing the embryos in the medium for 20 times, centrifuging the cell suspension by 5 590 ×g and culturing the cells at the density of 5×104cells/mL in the 96-well cell culture plates. The results proved efficient for BCs acquisition and activity detection, and benefitial for its application in the avian transgenic technology, especially for freezing injury evaluation in genetic resources preservation technology.

chicken; blastodermal cells (BCs) at stage X；primary cell culture；cell adherent rate

2014-10-14，

2014-12-01

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2013DFG31810)，湖南省科技計(jì)劃(2014WK2008)，長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃(K1307134-24)

王 坤(1990 -)，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：295443957@qq.com

*[通訊作者] 燕海峰(1969-)，男，湖南桃源人，研究員，博士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：hfyan2005@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)02-0061-06