張潔，王偉超，王虹，劉素波，李雅婷

（1.石家莊市第三醫(yī)院 眼科，河北 石家莊050011；2.石家莊市第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 石家莊050011；3.石家莊市第一醫(yī)院 干部老年病科，河北 石家莊050011；4.石家莊市第七醫(yī)院 健康檢查科，河北 石家莊050031）

近年來，糖尿病已成為排在心腦血管疾病和腫瘤之后的第三位影響人類健康的主要疾病。糖尿病引起的糖尿病性視網(wǎng)膜病變作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，為致盲的主要原因[1]，隨著糖尿病病程進展，發(fā)病率逐漸增高，病程10年以上發(fā)病率增至60%～90%[2]，嚴重地影響了糖尿病患者的生存質(zhì)量。有關(guān)2型糖尿病的病因與發(fā)病機制的探討中，糖尿病炎癥發(fā)病學(xué)說備受關(guān)注并得到認同，認為糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，炎癥因子引起的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)在糖尿病尤其是血管病變的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，多種炎癥因子參與了糖尿病視網(wǎng)膜的微血管病變[3]。其中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）是糖尿病微血管病變發(fā)展過程中起著重要作用的炎癥因子[4-5]。本試驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA試驗）對淚液、血清TNF-α 的濃度進行了測定，探討其與糖尿病及不同分期糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)生的關(guān)系，為臨床糖尿病病情監(jiān)測提供可能的新方法。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

LXJ-11型離心機（上海醫(yī)用儀器廠）；酶標儀（法國Jouan公司）；超低溫冰箱（法國Jouan公司）；TNF-α ELISA試劑盒（美國TBE公司），靈敏度>0.5 pg/ml。

1.2 試驗方法

1.2.1 病例選擇 正常對照組（NC組）50例，男25例，女25例，平均年齡63.1歲。均為健康志愿者，無眼病史，無糖尿病家族史，無藥物過敏史、服用糖皮質(zhì)激素及類似藥物史；2型糖尿病無糖尿病視網(wǎng)膜病變組（NDR組）50例，男25例，女25例，平均年齡65.4歲。經(jīng)檢眼鏡和眼底血管熒光造影排除糖尿病視網(wǎng)膜病變；單純性糖尿病視網(wǎng)膜病變組（DR組）50例，男27例，女23例，平均年齡65.7歲，經(jīng)檢眼鏡和眼底血管熒光造影確診為單純性糖尿病視網(wǎng)膜病變；增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變組（PDR組）50例，男24例，女26例，平均年齡66.8歲，經(jīng)檢眼鏡和眼底血管熒光造影確診為增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變。NDR組、DR組、PDR組均符合1999年WHO《2型糖尿病診斷標準》，患者起病年齡均>30歲，無酮癥發(fā)生，口服降糖藥有效，胰島自身抗體陰性，均無心、肺、腎、肝臟疾病，

以上四組人群的年齡、性別比例均相匹配。

1.2.2 標本采集 征求以上四組研究對象知情同意后分別采集其淚液和血液，采集過程均由同一人在相同條件下完成：受試者禁食、停藥8～10 h，檢查者動作輕柔，輕拉被檢者下瞼結(jié)膜并微后壓，以毛細玻璃管輕置于穹窿結(jié)膜與球結(jié)膜交界處，使淚液引流入毛細玻璃管，分別收集左、右眼淚液，每例受試者所取淚液樣本量為20μl，轉(zhuǎn)移至同一微量離心管，于超低溫冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫煌瓿蓽I液采集后抽取研究對象靜脈血3ml，采用離心機分離血清，超低溫冰箱-20℃凍存以備集中檢測。

1.2.3 淚液、血清TNF-α 濃度測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定人淚液、血清中TNF-α 的含量，嚴格按試劑盒說明進行操作。在ELISA檢測儀上，于450 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。以標準品濃度為橫坐標，以O(shè)D值為縱坐標，用平滑線連接各標準品的坐標點，繪制標準曲線，通過標本的OD值在標準曲線上查出其濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，分別對淚液、血清TNF-α 濃度進行單因素方差分析，若組間不同或不完全相同，再進一步做SNK-q檢驗比較各組間差別。并對淚液、血清TNF-α 水平作相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α在淚液中的含量

對NC組、NDR組、DR組、PDR組的各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，其F=129.636，表明各組間不同或不完全相同，再進一步做SNK-q檢驗比較各組間差別，結(jié)果表明：NDR組、DR組、PDR組淚液TNF-α 含量均較NC組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；DR組、PDR組淚液TNF-α 含量較NDR組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；PDR組淚液TNF-α 含量較DR組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。如附表所示。

2.2 TNF-α 在血清中的含量

對NC組、NDR組、DR組、PDR組的各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，其F=59.067，表明各組間不同或不完全相同，再進一步做SNK-q檢驗比較各組間差異，結(jié)果表明：NDR組、DR組、PDR組血清TNF-α 含量均較NC組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；DR組、PDR組血清TNF-α 含量較NDR組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；PDR組血清TNFα 含量較DR組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。如附表所示。

附表 淚液、血清中TNF-α 的含量

2.3 淚液TNF-α 與血清TNF-α 的相關(guān)分析

淚液與血液中的TNF-α 相關(guān)性關(guān)系為：r=0.751，P<0.05，95%可信區(qū)間為（0.31123，0.92586）。

3 討論

糖尿病可以引起多種并發(fā)癥，做為微血管并發(fā)癥之一的視網(wǎng)膜病變在發(fā)展中國家是導(dǎo)致成年人致盲的首要原因，其中黃斑水腫和增殖性視網(wǎng)膜病變是引起視力降低的主要原因，影響了12%的1型糖尿病患者和28%的2型糖尿病患者[6]。糖尿病炎癥發(fā)病學(xué)說認為，在糖尿病尤其是血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程中，炎癥因子引起的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)起到重要作用。這一學(xué)說備受關(guān)注并得到普遍認同，而其中的炎癥細胞因子TNF-α，在參與2型糖尿病及其血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用不容忽視。

TNF-α 主要由激活的單核細胞、巨噬細胞分泌，血管內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞也可合成，參與多種生理免疫過程，是具有多種生物活性的細胞因子[7]，有抗腫瘤、促進細胞生長、誘導(dǎo)細胞分化凋亡、影響糖脂代謝、誘導(dǎo)多種細胞因子產(chǎn)生等生物功能。TNF-α 基因啟動子多態(tài)性和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，大量證據(jù)表明TNF-α 參與胰島素抵抗的形成，與β 細胞分泌胰島素的關(guān)系密切[8]，在胰島素抵抗發(fā)病機制中起著重要作用，并且與糖尿病微血管病變關(guān)系密切。TNF-α 可抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物-1酪氨酸磷酸化，促進脂肪分解，使游離脂肪酸增多，誘導(dǎo)并加重了胰島素抵抗，促進糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。TNF-α 水平增高引起胰島素抵抗可引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的病理性增生，與亞臨床炎癥共同作用，引起糖尿病視網(wǎng)膜病變。有研究顯示[9-10]，血清TNF-α 水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變嚴重程度有顯著關(guān)聯(lián)。TNF-α可直接損傷血-視網(wǎng)膜屏障，通過核因子途徑的激活刺激人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞引起明顯的細胞間黏附分子和血管細胞黏附分子的表達，提高視網(wǎng)膜血管通透性；可刺激巨噬細胞及其他細胞產(chǎn)生IL-8等，增強視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)，JOUSSEN等[11]認為TNF-α 在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期的發(fā)生機制中發(fā)揮了重要的作用，其中部分歸功于其促炎活性。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可以誘發(fā)小鼠淚腺結(jié)構(gòu)和分泌發(fā)生顯著改變，糖尿病小鼠的淚腺重量和淚膜容量均較對照組低，而淚液中白介素1b和腫瘤壞死因子的濃度均較對照組高。TNF-α 可以提高視網(wǎng)膜血管通透性，從而刺激血管外基質(zhì)過量產(chǎn)生和血管細胞的增殖，最終導(dǎo)致眼內(nèi)新生血管形成。RIFAT等[12]通過對糖尿病性視網(wǎng)膜病變行玻璃體切除術(shù)的患者的研究，檢測其玻璃體樣品中TNF-α 的水平，研究結(jié)果顯示糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體樣本中TNF-α 水平明顯高于對照組患者，由此他們推斷：在視網(wǎng)膜新生血管形成中起重要作用的TNF-α 其濃度在糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體樣本中明顯升高。

通過對國內(nèi)外相關(guān)研究的調(diào)查表明，有關(guān)對糖尿病、糖尿病微血管病變患者血清中的TNF-α 水平研究較多，其研究發(fā)現(xiàn)血清TNF-α 作為重要的炎癥介質(zhì)，在糖尿病及其微血管并發(fā)癥患者中明顯升高。本研究對正常人（NC組）、2型糖尿病尚無視網(wǎng)膜病變患者（NDR組）、單純性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者（DR組）及增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者（PDR組）血清TNF-α 進行測定，結(jié)果表明TNF-α 含量：PDR組>DR組>NDR組>NC組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明糖尿病患者血清TNF-α 水平較正常人增高，隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，血清TNF-α 水平進一步升高，此結(jié)果與以往研究結(jié)論一致。

雖然淚液與血清同屬體液范疇，但關(guān)于淚液TNF-α 在糖尿病及其視網(wǎng)膜病變患者中的表達，國內(nèi)外很少有研究報道。淚液收集過程無創(chuàng)，易于被患者接受，可以用來進行臨床病情監(jiān)測。本研究又通過對糖尿病患者淚液TNF-α 的檢測，探討了淚液TNF-α 的水平與糖尿病及不同分期糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系，并進一步對淚液TNF-α 和血清TNF-α 做了相關(guān)性分析。本研究對NC組、NDR組、DR組、PDR組淚液TNF-α 分別進行了測定，結(jié)果表明TNF-α 含量：PDR組>DR組>NDR組>NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，淚液TNF-α 水平進一步升高。相關(guān)分析表明：淚液TNF-α 與血清TNF-α 變化趨勢一致，呈直線正相關(guān)關(guān)系。

總之，本試驗研究表明2型糖尿病患者淚液TNF-α 水平明顯升高，且隨糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重而升高，淚液TNF-α 與2型糖尿病及不同分期糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有關(guān)。血清TNF-α 與淚液TNF-α 的變化呈直線正相關(guān)關(guān)系，所以淚液TNF-α 的測定有望成為繼血清監(jiān)測之后的糖尿病病情監(jiān)測和評估的一種新方法。

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