胡萬(wàn)發(fā)，劉曉蕊，王健

（安徽理工大學(xué)1.附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 淮南232001）

肝細(xì)胞癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)生和轉(zhuǎn)歸與宿主的細(xì)胞免疫功能有關(guān)。外周血富含各類免疫活性細(xì)胞，主要為T淋巴細(xì)胞，可表達(dá)IL-2R等多種受體，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用[1]。CD25是IL-2R的α 亞單位，亦稱膜白細(xì)胞介素-2受體（membrane interleukin-2 receptor，m IL-2R），是T細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，在介導(dǎo)IL-2發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)上起關(guān)鍵作用[2]。為探討其在肝細(xì)胞癌的表達(dá)水平，本研究選擇59例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行外周血CD25及其mRNA檢測(cè)。報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

2010年1月-2011年5月住院的原發(fā)性肝癌患者59例，其中依病理分型，巨塊型肝癌14例，結(jié)節(jié)型肝癌26例，彌漫型肝癌19例?；颊吣?1例，女18例，平均年齡49.7歲，其中有18患者接受CIK（cytokine-induced killer）細(xì)胞治療。另隨機(jī)選取體檢正常人群20例為對(duì)照組，男12例，女8例，平均年齡38歲。

1.2 試劑與儀器

乙肝病毒標(biāo)志物（hepatitis B virus marker，HBVM）HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc診斷試劑購(gòu)自上?？迫A生物工程公司；淋巴細(xì)胞分離液（上海生化試劑二廠，批號(hào)100111）；生物素-鏈霉親和素（biotin-streptavidin，BSA）系統(tǒng)m IL-2R診斷試劑購(gòu)自上海思創(chuàng)生化電子有限公司；AFP放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：SI0912022）；Trizol試劑盒（美國(guó)Gaithersburg公司）；EXL-808全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Bio-Teck公司）；TaKaRa梯度PCR儀TP600（日本TaKaRa公司）；Hema-2000凝膠掃描分析系統(tǒng)（珠海Hema公司）；iCycle熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；MDF-135型CO2培養(yǎng)箱（日本Syno公司）。

1.3 方法

1.3.1 CD25檢測(cè) 靜息態(tài)CD25檢測(cè)：取肝素抗凝血2ml，以等量無Ca2+、Mg2+的Hanks'液稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，用Hanks'液洗滌3次，用含1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（1～3）×109/L，取上述細(xì)胞懸液10μl，分別涂布于印有防酸漆圈的玻片孔內(nèi)，自然干燥后用新鮮丙酮固定15～20min，干后于每一標(biāo)本印圈內(nèi)加抗Tac的單克隆抗體10μl，放入濕盒37℃、5%CO2環(huán)境孵育30min，然后用TBS漂洗，稍干后加生物素化羊抗鼠IgG 10μl于各孔中，同法孵育、漂洗，最終加新鮮配制的顯色液，待顯色明顯時(shí)用TBS漂洗，終止顯色，高倍鏡下鏡檢，細(xì)胞膜呈棕色者為陽(yáng)性，不著色者為陰性，共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。誘導(dǎo)態(tài)CD25檢測(cè)：取上述細(xì)胞懸液0.5ml，加入最終濃度為200μg/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）的1640完全培養(yǎng)液0.5ml，置37℃、5%CO2環(huán)境孵育72 h。取沉淀細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)液稀釋至（1～3）×109/L，同法涂片、孵育、漂洗、鏡檢，行誘導(dǎo)期m IL-2R檢測(cè)。

1.3.2 CD25 mRNA檢測(cè) 取PHA孵育前后患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），以RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（1～2）×106/ml。用Trizol試劑抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA置-86℃冰箱備檢。用SYBR Green I熒光標(biāo)記法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，總反應(yīng)體系為25μl，2μl標(biāo)準(zhǔn)品或模板cDNA，模板cDNA以1∶4稀釋。CD25 mRNA引物設(shè)計(jì)參照HIRATA等[3]方法，引物序列：sense（5'→3'）為CAAAGTCCAATGCAG CCAGT，Anti-sense（5'→3'）為TCACCTGTGCATAT GAGCTG，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度232 bp。以GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，每次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度稀釋6個(gè)梯度（106、105、104、103、102和10 copies/ml） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物sense（5'→3'）：AGAAGGCTGGGGCTCATTTA，anti-sense（5'→3'）：為AGGGGCCATCCACAGTCTTC，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為258 bp。擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性300 s，95℃ 10 s，65℃10 s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫300 s，4℃保存。為克服系統(tǒng)誤差，設(shè)GAPDH為參照，以lgcDNA/lgGAPDH比值代表其最終mRNA水平。

1.4 CIK細(xì)胞制備

參照BONANNO等[4]方法，臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測(cè)CIK細(xì)胞活度>95%，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CIK細(xì)胞中CD3+CD8+CD56+含量>80%以確定靶細(xì)胞。CIK細(xì)胞治療方法：取新鮮制備CIK細(xì)胞，每次以2.0×1010濃度細(xì)胞懸液輸注100ml，每天1次，連續(xù)5 d，其他參照郝一文等[5]方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

與正常對(duì)照相比，肝細(xì)胞癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PHA誘導(dǎo)前后CD25及其mRNA水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體見圖1～2。CIK細(xì)胞治療后，靜息期和誘導(dǎo)期CD25及其mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3～4。

圖1 肝癌患者外周血CD25表達(dá)

圖2 肝癌患者外周血CD25 m RNA表達(dá)

圖3 肝癌患者CIK細(xì)胞治療前后CD25表達(dá)

3 討論

肝細(xì)胞癌是目前公認(rèn)的惡性腫瘤，其確切的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為與宿主的細(xì)胞免疫功能有關(guān)。PBMCs是多種免疫活性細(xì)胞的集合體，主要是T淋巴細(xì)胞，可表達(dá)IL-2R，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要作用。

圖4 肝癌患者CIK細(xì)胞治療前后CD25mRNA表達(dá)

IL-2R是IL-2的特異性受體，包括α、β、γ三個(gè)亞單位，分別稱為CD25、CD122、CD132，其中以CD25較重要，是T細(xì)胞活化的標(biāo)志，在IL-2發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)上起關(guān)健作用，其表達(dá)水平可反映T細(xì)胞的激活過程和機(jī)體的免疫狀態(tài)[6]。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者外周血PHA誘導(dǎo)前后CD25表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示肝癌患者存在明顯的細(xì)胞免疫功能低下，T細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，不能表達(dá)足夠的CD25，限制宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。T細(xì)胞表面除表達(dá)CD25外，還含有PHA受體。以PHA誘導(dǎo)后，CD25表達(dá)水平雖較靜息期明顯提高，提示患者對(duì)PHA刺激仍有相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性，但與正常對(duì)照相比表達(dá)水平仍較低，差異性仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示肝癌患者T細(xì)胞對(duì)PHA的誘導(dǎo)反應(yīng)弱，活化的T細(xì)胞減少或不足[7]。進(jìn)一步觀察不同病理分型患者外周血CD25表達(dá)情況，結(jié)果顯示巨塊型、結(jié)節(jié)型、彌漫型肝癌患者外周血CD25及其mRNA表達(dá)水平類似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示肝癌患者的細(xì)胞免疫功能低下與病理分型無關(guān)。

CD25 mRNA是反映編碼或調(diào)控CD25表達(dá)和分泌的新型指標(biāo)，在活化性T細(xì)胞高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示肝癌患者PBMCs在靜息狀態(tài)下CD25mRNA水平較低，提示患者外周血中T細(xì)胞合成分泌CD25的能力較弱。當(dāng)PBMCs與PHA共孵育后，CD25mRNA水平顯著升高，但與對(duì)照組相比仍有較大差異（P<0.05），提示PHA能非特異性刺激T細(xì)胞活化增殖，但其活化能力仍較正常者低，這種低活性T細(xì)胞限制宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。近年來，多項(xiàng)研究表明，肝細(xì)胞癌與HBV、HCV感染密切相關(guān)，HBV不僅對(duì)肝細(xì)胞具有高度的親和性，還可侵犯PBMCs、淋巴結(jié)、腎臟等，形成肝外感染。當(dāng)HBV侵入PBMCs，一方面在其中復(fù)制增殖[8]，甚至通過整合酶形成cccDNA，與宿主細(xì)胞基因整合；另一方面促使T細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量血清可溶性白細(xì)胞介素-2受體（soluble interleukin-receptor，sIL-2R），此與CD25產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，限制CD25的表達(dá)[9-10]。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，不同病理類型的肝癌患者PHA誘導(dǎo)前后CD25 mRNA水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示肝癌患者的CD25 mRNA表達(dá)與病理分型無關(guān)[11]。

CIK細(xì)胞是PBMCs在體外多種細(xì)胞因子（如抗-CD3單抗、IL-2、IFN-γ、IL-1α）共同作用下，獲得的一群以CD3+CD56+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，具有高增殖潛能的免疫細(xì)胞[12]。肝癌患者采用CIK細(xì)胞治療后，發(fā)現(xiàn)外周血靜息期和誘導(dǎo)期CD25及其mRNA表達(dá)均明顯升高，提示由于IL-2等刺激，誘導(dǎo)患者T細(xì)胞活化，促進(jìn)細(xì)胞表面表達(dá)IL-2R，活化的T細(xì)胞通過自分泌和旁分泌效應(yīng)誘導(dǎo)周邊的T細(xì)胞活化，形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，從而暫時(shí)糾正患者細(xì)胞免疫功能低下的表現(xiàn)，患者病情得以控制和緩解[13]。有條件的醫(yī)院可定期為患者輸注CIK細(xì)胞，使體內(nèi)活化的T細(xì)胞維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，以糾正細(xì)胞免疫功能紊亂，改善患者生存質(zhì)量。

綜上所述，肝癌患者細(xì)胞免疫功能明顯低下，主要表現(xiàn)為外周血CD25及其mRNA水平降低，其降低程度與病理分型無關(guān)。PHA可體外誘導(dǎo)患者PBMCs表達(dá)CD25。CD25可作為觀察患者細(xì)胞免疫功能和評(píng)估療效的輔助指標(biāo)。

[1]KORANGY F,H?CHST B,MANNSMP,et al.Immune responses in hepatocellular carcinoma[J].Dig Dis,2010,28(1):150-154.

[2]LU ZH,CHEN W,JU CX,et al.CD25 is a novel marker of hepatic bile canaliculus[J].Int J Surg Pathol,2012,20(5):455-461.

[3]HIRATA H,ARIMA M,CHENG G,et al.Production of TARC and MDC by naive T cells in asthmatic patients[J].J Clin Immunol,2003,23(1):34-35.

[4]BONANNO G,IUDICONE P,MARIOTTI A,et al.Thymoglobulin,interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer(CIK)cells in clinical-grade cultures[J].J Transl Med,2010,8:129.

[5]郝一文,和予馨,周文玲.自體外周血單個(gè)核細(xì)胞制備CIK細(xì)胞治療惡性實(shí)體腫瘤應(yīng)用價(jià)值研究[J].中國(guó)輸血雜志,2011,24(9):746-749.

[6]MALEK TR,CASTRO I.Interleukin-2 receptor signaling:at the interface between tolerance and immunity[J].Immunity,2010,33(2):153-165.

[7]WANG J,JIANG SQ,XIANG GJ.Relationship between expression of HBVx-DNA in peripheral blood of the patients with chronic hepatitis B[J].Chin J Public Health,2006,22(10):1187-1189.

[8]WANG KX,ZHANG LH,PENG JL,et al.Effect of liniment levamisole on cellular immune functions of patients with chronic hepatitis B[J].World J Gastroenterol,2005,11(45):7208-7210.

[9]CABRERA R,ARARAT M,EKSIOGLU EA,et al.Influence of serum and soluble CD25 (sCD25)on regulatory and effector T-cell function in hepatocellular carcinoma[J].Scand J Immunol,2010,72(4):293-301.

[10]WANG J,WANG Y,XIANG GJ.The influence of PBMC infected by HBV on the expression of CD25 mRNA in immune cells of the patients[J].Chin J Microbiol Immunol,2007,27(6):523-524.

[11]OHIRA M,NISHIDA S,TRYPHONOPOULOS P,et al.Clinical-scale isolation of interleukin-2-stimulated liver natural killer cells for treatment of liver transplantation with hepatocellular carcinoma[J].Cell Transplant,2012,21(7):1397-1406.

[12]PAN K,LI YQ,WANG W,et al.The efficacy of cytokine-induced killer cell infusion as an adjuvant therapy for postoperative hepatocellular carcinoma patients[J].Ann Surg Oncol,2013,20(13):4305-4311.

[13]MORISAKI T,ONISHI H,KOYA N,et al.Combinatorial cytotoxicity of gemcitabine and cytokine-activated killer cells in hepatocellular carcinoma via the NKG2D-MICA/B system[J].Anticancer Res,2011,31(7):2505-2510.