于新友 李天芝 劉吉山 沈志強，

(1山東綠都生物科技有限公司 山東濱州 256600 2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東濱州 256600)

鴨瘟（duckplague，DP）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的鴨、鵝等水禽的敗血性、高度致死性傳染病[1]，其特征為兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大[2]。是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的傳染病之一[3]，是OIE規(guī)定的B類傳染病，給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失[4]。1923年，Baudet[5]首次報道荷蘭的家鴨暴發(fā)鴨瘟。目前，該病呈世界性分布，1957年我國首次報道該病。檢測DPV的常規(guī)方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附和瓊擴試驗等，這些方法均有較多缺點如耗時長、檢測敏感性較低及準確性差等，尤其對處于潛伏期的鴨不能檢出其體內(nèi)的DPV感染。PCR具有檢測速度快、特異性好和靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于細菌、病毒的診斷檢測并展示其良好的應用前景。而應用PCR技術對鴨瘟進行診斷，能快速地檢測出是否有DPV，是常規(guī)檢測方法無法比擬的。因此，建立1種DPV病毒PCR檢測方法對于DPV的早期臨床診斷，從而采取適當?shù)拇胧?，防止鴨瘟的大?guī)模暴發(fā)有很重要的意義。

本研究根據(jù)GenBank公布UL30（EF554403）基因序列，設計了1對特異性引物，建立了1種特異、敏感的DPV檢測方法，旨在為DPV的早期診斷、流行病學調(diào)查等提供1種有效的分子生物學檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

鴨瘟病毒、鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒由本實驗室分離、保存，臨床檢測病料2014年采自山東省各地鴨場臨床診斷為DPV感染的鴨的肝臟、脾臟等。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、PCR相關試劑、DNAMarKer，DNA凝膠回收試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品，AxyPrep體液病毒DNA/DNA小量試劑盒為愛思進生物技術(杭州)有限公司產(chǎn)品。

1.3 PCR引物設計與合成

參照 GenBank中登錄的 DPV 基因序列（EF554403），應用PrimerPremier5.0基因分析軟件，設計1對引物，擴增DPV UL30基因部分片段510bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-CGACTACATCCATACCCACT-3′，下游引物：5′-TATGCTTCAGCTAGAGTA-3′。

1.4 病毒基因組DNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/DNA小量試劑盒使用說明書提取DPV的DNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 DPVUL30基因的PCR擴增及條件優(yōu)化

以DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25μL。各參數(shù)為95℃預變性5min，然后進入95℃30s、47℃30s，72℃30min循環(huán)，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取3μL產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像。同時對各擴增條件進行優(yōu)化，包括退火溫度(43～53℃梯度溫度，每2℃為1個梯度)、引物濃度(0.2～1.2μmol/L，每0.2μmol/L為1個梯度)等，反應體系均為25μL。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴增產(chǎn)物3μL在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)。挑取單個的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液，37℃培養(yǎng)16h，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。將測序結(jié)果與參照的DPV序列同源性比較。

1.7 特異性試驗

分別提取鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒的核酸，用已建立的方法進行擴增。

1.8 敏感性試驗

提取DPV病毒DNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組DNA，使其分別相當于含有10ngDNA、1ngDNA、100pgDNA、10pgDNA、1pgDNA和0.1pgDNA的含量，分別進行PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復性試驗

用建立的PCR檢測方法對鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨H9亞型禽流感病毒、鴨副黏病毒、鴨瘟3份陽性病料及3份陰性病料，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測

取疑似送檢病料15份，利用建立的PCR方法進行檢測，對擴增產(chǎn)物全部進行測序鑒定，并利用生物學軟件BLAST進行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物的檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物在510bp處可見特異性DNA擴增條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 特異性試驗

利用所設計的引物及所確定的最佳反應條件分別對鴨瘟病毒、鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒分別進行PCR擴增。結(jié)果7個毒株中只有鴨瘟病毒能擴增出相應的片段，大小為510bp，而其他均未擴增出相應的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性好。

2.3 敏感性試驗

取3μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約510bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，引物的PCR檢測靈敏度可以達到1pgDNA（圖3）。

2.4 重復性試驗

經(jīng)過3 次重復操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2.5 臨床樣品的檢測

用建立的DPVPCR檢測方法，共檢測了15份在不同地方采集的鴨病料，檢出陽性樣品3份。

3 討論

傳統(tǒng)DPV診斷方法，如病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附和瓊擴試驗方法，操作繁瑣，操作耗時長，重復性不好，限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應用。PCR檢測方法具有檢測速度快、敏感高和特異好等優(yōu)勢，能在數(shù)小時內(nèi)檢出病原。因此，建立1種快速、簡單和敏感的DPVPCR檢測方法十分必要。

圖1PEDV擴增結(jié)果

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

本試驗對GenBank公布的DPV基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)DPVUL30基因相對比較保守，查找出其高度保守區(qū)域，參照GenBank中登錄的DPV基因序列（EF554403）利用PrimerPremier5.0設計1對引物，通過PCR擴增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結(jié)果與模板序列進行比對，其同源性為100%，對退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當退火溫度值為47℃時，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結(jié)果。對引物濃度進行優(yōu)化，在引物濃度為0.2～1.2μmol/L對PCR擴增效率的影響不大，在0.6μmol/L時擴增效率相對較高，而在1.2μmol/L時擴增效率相對較差。敏感性試驗結(jié)果顯示，引物的檢測靈敏度可以達到1pgDNA。特異性試驗結(jié)果顯示，本試驗所建立的PCR檢測DPV的方法能夠擴增出510bp目的片段，而對常見的鴨病病毒如鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒均無擴增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的DPVPCR檢測方法，共檢測了15份在不同地方采集的鴨病料，檢出陽性樣品3份。因此，本試驗所建立的方法為DPV的診斷、流行病學調(diào)查等提供了1種簡單、快速的分子診斷方法。

[1]殷震，劉景華.動物病毒學（第二版）[M].北京：科學出版社，1997.

[2]PlummerPJ，AlefantisT，KaplanS，eta1.Detection ofenteritisvirusbypolymerasechainreaction[J].Avian Diseases，1998，42：554-564.

[3]甘孟侯.中國禽病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999，109-119.

[4]岳華，湯承，余勇，等.禽病臨床診斷彩色圖譜[M].成都：四川科技出版社，2002.

[5]BaudetA E R F.Mortality in ducksin the Netherlandscausedbyafiltrablevirus；fowlplague[J].TijdschrDiergeneeskd，1923，（50）：455-459.