趙 勤 范懷玲 紀(jì) 峰 林 鶯 吳 強

福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122

電針命門穴對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨OPG/RANKL系統(tǒng)的影響

趙 勤 范懷玲 紀(jì) 峰 林 鶯 吳 強*

福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122

目的:研究電針命門穴對去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨OPG/RANKL系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號分子骨保護素(OPG)、核因子Kappa B受體因子配體(RANKL)蛋白表達的影響。方法:將4～5月齡SD雌性大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Ovx)、電針命門組(GV4)、電針非經(jīng)非穴組(Mock)，每組各10只。除假手術(shù)組外，各組大鼠均切除雙側(cè)卵巢(ovariectomy ,OVx)制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。命門組和非經(jīng)非穴組每日電針1次，頻率為2Hz，強度為1mA，每次持續(xù)20min，10d為一個療程，治療3個療程；模型組和假手術(shù)組不進行干預(yù)，給予相同的套頭、抓取、固定操作，療程同針刺組。3個療程后檢測各組大鼠骨生物力學(xué)、骨密度以及大鼠股骨OPG、RANKL蛋白的表達情況。結(jié)果:和模型組相比較，電針命門穴能夠顯著改善Ovx大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)松散、排列紊亂、密度降低的骨質(zhì)疏松形態(tài)學(xué)改變，改善股骨最大載荷和斷裂載荷，并提高骨密度，與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；免疫組化結(jié)果表明電針命門穴能夠激活OPG、RANKL的表達。然而電針非經(jīng)非穴組不能顯著改善上述生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)論:通過激活OPG/RANKL信號通路、提高骨代謝過程中的骨形成并增強骨強度可能是電針命門穴治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機制之一。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；命門穴；OPG；RANKL

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis, PMOP)是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，在骨代謝過程中骨吸收大于骨形成，從而以低骨量和骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)槠涮卣鳎R床表現(xiàn)為骨脆性和骨折易感性增加的一種代謝疾病[1]，可歸為中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇。

命門，又名“精宮”，歸屬于督脈，陳士鐸在《石室秘錄》中說：“腎得命門而作強”，具有很強的培元補腎的作用，能針對PMOP的病機起治療作用。本課題的前期研究已證明，針刺命門穴治療可以改善腎精不足、骨失濡養(yǎng)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，并且通過上調(diào)骨形成蛋白-2(BMP-2)來改善骨吸收是其重要的分子生物學(xué)機制之一[2-7]。

骨保護素(osteoprotegerin, OPG)和核因子Kappa B受體活化因子配體(receptor of activator of nuclear factor B-ligand, RANKL)作為破骨細(xì)胞形成、分化和骨吸收調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，OPG/RANKL系統(tǒng)被證實與骨質(zhì)疏松等骨科疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[8-11]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 4～5月齡SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量為250～290g,購自福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物批號：2007000530580。用隨機數(shù)字表法，將40只大鼠分為造模組30、假手術(shù)組(Sham)10只，然后將造模組隨機分為模型組(Ovx)、電針命門組(GV4)、電針非經(jīng)非穴組(Mock)三組，每組各10只。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 美國公司的DEXL雙能X線骨密度儀；萬能材料實驗機 (島津，AG-IC 20KN，日本)；光學(xué)顯微鏡(YS2-H，尼康，上海普赫光電科技有限公司)；MOTIC6.0圖像分析軟件(廈門麥克奧迪有限公司)；OLYMPUS 1x70倒置顯微鏡；0.5寸針灸針(0.30x13mm，廠家：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；電針儀(華佗SDZ-V，廠家：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、載玻片、注射器、棉簽、紗布、手術(shù)刀、剪刀、塑料手套及棉手套(福州貝爾曼生物技術(shù)有限公司供)。

1.2.2 試劑 即用型 SABC 免疫組化染色試劑盒 (博士德公司) ；DAB 顯色試劑盒(博士德公司)；2%的戊巴比妥鈉(麻醉用)；戊酸雌二醇(廣州,先靈藥業(yè)有限公司)；0.9%氯化鈉溶液、青霉素(4萬U/ml)、75%酒精(福州貝爾曼生物技術(shù)有限公司供)；4%多聚甲醛。

1.3 模型制備 按照文獻[12]方法造模。腹腔注射2%的戊巴比妥鈉，按照0.2ml/100g的劑量進行麻醉。于腹正中線切開皮膚，逐層分離皮下組織及肌肉筋膜進入腹腔，可見乳白色組織，輕輕將之提出腹腔，找到被包裹的粉紅色黃豆大小“?？皹印甭殉?，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢，分層縫合肌肉、皮膚。假手術(shù)組10只大鼠采用上述相同的操作方法進行，但在找到卵巢后并不切除卵巢，而是切除卵巢周圍的等量的軟組織，余下處理同造模組。

術(shù)后，給大鼠腹腔注射青霉素生理鹽水(4萬U/ml)抗炎，每天注射1ml，連續(xù)3d。所有大鼠分籠按常規(guī)喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，室溫控制在(22±1)℃，濕度60%，噪音<50分貝，光照與黑暗時間為每12h交替。造模完成后5d開始進行陰道脫落細(xì)胞涂片檢測，觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片細(xì)胞學(xué)變化，判斷大鼠是否去勢完全。造模成功后喂養(yǎng)12周，用美國公司的DEXL雙能X線骨密度儀檢測骨密度，記錄骨密度數(shù)據(jù)，確定絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型成功。此后，開始進行干預(yù)。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 選穴 穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[13]。

1.4.2 命門組 “命門”：第2腰椎棘突下凹陷；操作：將大鼠黑色布手套頭固定，穴位局部剪去鼠毛，常規(guī)消毒，采用0.5寸針灸針，連接電針(SDZ-V)，其中一側(cè)電極連接腧穴，另一側(cè)電極連接到大鼠尾巴中段左側(cè)，頻率為2Hz，波形為疏密波，強度1.0mA，每日上午9：00～11：00電針1次，每次電針持續(xù)20min，10d為1個療程，療程間休息一天，共治療3個療程。

1.4.3 非經(jīng)非穴組 “非經(jīng)非穴”：脅下髂嵴上20～25mm，后正中線旁開20mm處。電針操作同電針命門組。

1.4.4 模型組 不進行針刺，抓取及套頭等干預(yù)方法同針刺組。期間，各組動物均正常飲食，自由飲水。余同電針組。

1.4.5 假手術(shù)組 不進行針刺，抓取及套頭等干預(yù)方法同針刺組。期間，各組動物均正常飲食，自由飲水，余同電針組。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 骨密度檢測 干預(yù)1個月后，在2%戊巴比妥鈉2ml/kg麻醉下，將大鼠仰躺固定于木板上，用美國公司的DEXL雙能X線骨密度儀及其所附的小動物軟件，記錄骨密度指數(shù)。

1.5.2 取樣 將大鼠處死，取大鼠兩側(cè)股骨，去掉股骨頭端附著的肌肉韌帶, 左側(cè)股骨置于10%中性甲醛溶液中，4℃保存, 備行免疫組織化學(xué)檢測。右側(cè)股骨采用生理鹽水紗布包裹，放于-20℃的冰箱中。

1.5.3 HE染色 取大鼠股骨頭部分，置于10%多聚甲醛固定48h，用 10%EDTA(pH7.2)脫鈣，每周更換1次，約 42d。脫鈣至大頭針無明顯阻力通過，流動水沖洗24h，常規(guī)酒精上行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片5mm,并附于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃過夜，然后脫蠟、入水沖洗、PBS洗兩次。蘇木素染液染色7min，70%乙醇浸泡30min，脫去胞質(zhì)著色，堿性液堿化，蒸餾水漂洗1min，伊紅染液染色40sec，梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次，干燥，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)，判斷去勢完全的大鼠是否患有骨質(zhì)疏松癥。

1.5.4 右側(cè)股骨放在津島AG—IC20KN 萬能材料實驗機測股骨生物力學(xué)性能 三點彎曲實驗，將股骨置于實驗機上(生理鹽水澆灌標(biāo)本以保持溫度，室溫23 ℃)，各個股骨按照股骨頭凹面朝下，股骨頭端朝前的位置放置，壓頭大概在股骨長度中間位置的正上方，調(diào)節(jié)壓頭最接近股骨的位置但不觸碰到股骨，避免對股骨產(chǎn)生壓力，跨距24mm，加載速度2mm/min，直至股骨斷裂，記錄最大載荷和斷裂載荷值，股骨斷裂前所能承受的最大力為最大載荷，股骨斷裂時所承受的力為斷裂載荷。

1.5.5 免疫組化 取大鼠股骨頭部分,置于 10%多聚甲醛固定48h，用 10%EDTA(pH7.2)脫鈣，每周更換1次，約 42d。脫鈣至大頭針無明顯阻力通過，流動水沖洗24 h，常規(guī)酒精上行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片5mm,嚴(yán)格按即用型SABC試劑盒說明書操作, PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照，一抗稀釋倍數(shù)均為 1∶100。每張切片隨機選5個視野(×400) 應(yīng)用 OLYMPUS1×70倒置顯微鏡觀察并拍照, 運用廈門麥克奧迪有限公司 MOTIC6.0 圖像分析軟件對每張照片進行OPG、RANKL表達的陽性細(xì)胞個數(shù)及灰度值進行測量，每張、每組切片取其平均值。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn): 當(dāng)細(xì)胞膜、胞漿和或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色陽性物質(zhì)為陽性細(xì)胞。用平均灰度值表示染色強弱。

2 結(jié)果

2.1 大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片結(jié)果 鏡下見細(xì)胞稀疏且細(xì)胞核大、核漿比例大，或滿視野不成熟小細(xì)胞(呈成片或成串小紫葡萄)，提示去卵巢成功，見圖1。

2.2 各組大鼠股骨骨組織形態(tài)結(jié)果 模型組大鼠的骨小梁與假手術(shù)組大鼠比較，數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，排列紊亂，密度和面積明顯變小，而骨髓腔，明顯變大，有大量的脂肪和空泡，表現(xiàn)出典型的骨質(zhì)疏松癥骨組織形態(tài)。電針命門穴能夠顯著改善大鼠卵巢去勢誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變，而非經(jīng)非穴組不能明顯改善大鼠卵巢去勢引起的骨質(zhì)疏松，詳見圖2。

2.3 各組大鼠股骨骨生物力學(xué)結(jié)果及骨密度結(jié)果 模型組骨密度與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.05)；命門組與模型組相比顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度比較 ±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

模型組最大載荷、斷裂載荷與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.05)；命門組與模型組相比最大載荷、斷裂載荷均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨生物力學(xué)最大載荷、斷裂載荷比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.4 電針對各組大鼠OPG、RANKL表達的影響 大鼠股骨OPG、RANKL蛋白表達結(jié)果(免疫組化, ×100)。棕色或者棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞染色深表示其強陽性表達。

OPG、RANKL蛋白的表達水平與陽性目標(biāo)總面積和陽性目標(biāo)平均灰度有關(guān)。陽性目標(biāo)總面積表示股骨OPG、RANKL蛋白分布面積的大小，面積越大，OPG、RANKL蛋白分布的越廣泛?；叶戎当硎綩PG、RANKL蛋白表達的強弱，灰度值越低，OPG、RANKL蛋白陽性表達越強。命門組的灰度值(P>0.05)，與其他三組相比較數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表示OPG、RANKL蛋白的強陽性表達。綜合OPG、RANKL蛋白陽性目標(biāo)總面積和陽性目標(biāo)平均灰度，命門組OPG、RANKL蛋白的表達量最多，模型組與命門組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；命門組與非經(jīng)非穴組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

3 討論

中醫(yī)經(jīng)典上記載“腎藏精，主骨生髓，其充在骨”。腎為先天之本，主骨生髓，骨的生長、發(fā)育、強勁與衰弱和腎精有密切的關(guān)系，腎精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養(yǎng)而強勁有力，腎精虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)而痿弱無力?！端貑枴つ嬲{(diào)論篇》：“腎不生，則髓不能滿；水不勝火，骨枯而髓虛，足不任身”?！端貑枴っ}要精微論篇》中闡述了腎、骨、髓之間的病理聯(lián)系，說明腎精不足、骨髓失養(yǎng)則骨髓脆弱無力。因此，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛是形成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的基本病機[14]。命門穴為“元陽聚積之處”， “腎得命門而作強”,電針命門穴可溝通兩腎之陰陽水火，補養(yǎng)機體先天之精氣，具有補益先天，強腎固本，溫督壯陽的作用。本研究選用“命門”穴正是針對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎虛精虧髓虛的實質(zhì)而定。

OPG和RANKL作為破骨細(xì)胞形成、分化和骨吸收調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，OPG/RANKL系統(tǒng)被證實在骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等[8-11]骨科疾病的發(fā)病機制及治療方面具有重要作用。在骨重塑過程中，降低破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性是防治骨質(zhì)疏松癥的重要策略[15]。RANKL又稱骨保護素配體(osteoprotegerin ligand, OPGL)，為破骨細(xì)胞表面核因子Kappa B 受體活化因子(receptor of activator of nuclear factor Kappa B，RANK)的配體，主要由成骨細(xì)胞及其前體表達，通過旁分泌方式與破骨細(xì)胞前體或破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，促進破骨細(xì)胞的生成和活化。OPG在骨組織中由成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，為RANKL的餌受體，可競爭性結(jié)合RANKL，封閉RANKL與RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生、分化和成熟，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。RANKL/OPG比例的變化對于破骨細(xì)胞產(chǎn)生至關(guān)重要，一般來說，當(dāng)RANKL/OPG的比值上升，破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性將增加，RANKL/OPG的比例下降時，破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性將降低。 總之，正常的骨重建和骨量的穩(wěn)定依賴于OPG和RANKL的平衡，OPG/RANKL的比值是評估骨重塑過程的指標(biāo)[16-24]。

本研究通過電針命門穴的治療，大鼠股骨OPG和RANKL蛋白表達量增多，治療前后大鼠股骨骨密度增加，治療組比模型組骨生物力學(xué)最大載荷和斷裂載荷增大，OPG/RANKL系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號分子OPG和RANKL蛋白表達強陽性，可以提示電針命門穴的治療機制是通過OPG/RANKL系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號分子OPG和RANKL為靶點，改善骨質(zhì)疏松癥的。

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Effect of electroacupuncture stimulation at Mingmen point on ovariectomy-induced osteoporosis in rats

ZHAO Qin,FAN Huai-ling,JI Feng,LIN Yin,WU Qiang

College of Acu-moxibustion,Fujian University of Chinnese Medicine,Fuzhou 350122，China

Objective To observe the effect of electroacupuncture at Mingmen point on OPG/RANKL signaling of femur in postmenopausal osteoporosis rats.Methods 4-5 month female SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham),model group (OVx),electroacupuncture Mingmen group(GV4),electroacupuncture non-acupoint group (Mock).Except for the sham group, the rats were performed ovariectomized(ovariectomy,OVx)to induced the model of postmenopausal osteoporosis.After the models were prepared,rats from different group were performed relatively treatment.After 3 courses of treatment,bone miner density，biomechanics and OPG/RANKL signaling by different method.Results staining results suggested electroacupuncture at Mingmen point can significantly improve the morphological changes of osteoporosis in ovariectomized rats.And electroacupuncture at Mingmen point could improve the maximum load and fracture load,as well as the bone density(P<0.01);Immunohistochemical results suggest that electroacupuncture at Mingmen point can activate the OPG/RANKL signaling pathway.Conclusion Electroacupuncture at Mingmen point can improve the effect of bone metabolism in the process of bone formation,and activing the OPG/RANKL signaling pathway might be one of the mechanism by which the electroacupuncture at Mingmen point treating the postmenopausal osteoporosis.

Postmenopausal osteoporosis；Mingmen point；OPG；RANKL

國家自然科學(xué)基金面上項目(81173347/H2718)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81102651/H2718)。

趙勤(1983-)，女，碩士研究生，研究方向：針灸調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的基礎(chǔ)與臨床研究。

吳強，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：針灸對內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)與臨床研究。

R245.9+7

A

1007-8517(2015)07-0026-05

2015.01.28)