劉 英，向 迪，倪浩翔，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004）

豬胰α-淀粉酶（pig pancreaticα-amylase）是由豬胰腺分泌的一種能夠水解α-1,4-糖苷鍵的酶，目前廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)、畜牧業(yè)、制藥工業(yè)等。但是，目前市場(chǎng)上的α-淀粉酶的主要來自于國(guó)外進(jìn)口的微生物發(fā)酵產(chǎn)品，其制備成本較高，提取條件相對(duì)復(fù)雜，并且α-淀粉酶得率很低[1]。豬胰臟作為α-淀粉酶的提取原料來源充足，而且豬胰α-淀粉酶與人胰α-淀粉酶更為接近，兩者的分子質(zhì)量均為46 ku，最適pH值均為6.7～7.0[2]。在藥物機(jī)理研究或某些治療性藥物研發(fā)中，豬胰α-淀粉酶相對(duì)于微生物來源的α-淀粉酶具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[3]。另外，由于豬胰臟口感不佳，不受大眾喜歡，很多屠宰場(chǎng)是直接丟棄的。豬胰臟作為胰α-淀粉酶的制備原料，價(jià)格低廉，生產(chǎn)成本低。

雙水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）技術(shù)是一種分離純化某些生物大分子的有效方法。在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面應(yīng)用廣泛，是一種有很大發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)[4]。雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成的或者是一種鹽與一種水溶性聚合物組成的體系[5]。與傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)相比，雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)具有以下優(yōu)勢(shì)：萃取環(huán)境溫和，體系中聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護(hù)的作用；體系中含水量極高，一般在80%以上，同時(shí)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和硫酸鹽溶液均具有維持生物分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，因此蛋白質(zhì)在雙水相體系中不易變性；易于連續(xù)操作和生產(chǎn)工藝放大，該系統(tǒng)甚至可直接放大40 000倍；處理容量大，能耗低；不存在有機(jī)溶劑殘留，PEG是化妝品中的常見成分，對(duì)生物分子及人體均無危害[6]。目前已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)、核酸、病毒和抗生素等通過雙水相進(jìn)行了成功的分離[7-10]。1956年，瑞典科學(xué)家ALBERTSSON P A[11]首次采用雙水相萃取法分離純化生物大分子，考察了生物大分子在雙水相系統(tǒng)中的分配行為，為雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。20世紀(jì)70年代以后，HUSTEDT H等[12]開始嘗試將雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。1980年以后，國(guó)內(nèi)也開展了相關(guān)的研究，楊基礎(chǔ)等[13]采用聚乙二醇/磷酸鹽雙水相體系成功的從枯草桿菌發(fā)酵液中提取到α-淀粉酶。郅文波等[14]成功構(gòu)建了α-淀粉酶的雙水相系統(tǒng)純化模型，為雙水相系統(tǒng)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

本研究以價(jià)格低廉、來源廣泛的豬胰臟作為制備原料，采用PEG1500/（NH4）2SO4雙水相體系對(duì)豬胰α-淀粉酶分離條件進(jìn)行研究，以期為工業(yè)提取胰α-淀粉酶提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰臟：廣西桂林環(huán)城北二路屠宰場(chǎng)，廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存；PEG400、PEG1500、PEG4000：錦山化工有限公司；硫酸銨[（NH4）2SO4]：廣州市德松化工有限公司；甲醛、硫酸（H2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）：汕頭市西隴化工有限公司；磷酸鈉：浙江東越化工有限公司；可溶性淀粉：天津市基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：廣州市榕晟化工有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S型電子天平：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；XL.39-YYQ移液槍：加拿大BBI公司；TDL-80-2B型飛鴿低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 雙水相體系中水分含量的測(cè)定[15]

水分含量測(cè)定采用烘箱干燥法：雙水相體系總液經(jīng)電子天平測(cè)質(zhì)量后放入烘箱中80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，再次測(cè)定其質(zhì)量。雙水相體系的水分含量計(jì)算公式如下：

式中：W1為雙水相體系的水分含量，%；m1、m2分別為烘干前后雙水相體系的質(zhì)量，g。

1.3.2 硫酸銨含量的測(cè)定[16]

硫酸銨含量的測(cè)定采用甲醛法：（NH4）2SO4與甲醛作用，生成六次甲基四胺鹽N4（CH2）6、H2SO4及水，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2SO4和N4（CH2）6，通過所消耗的NaOH的體積求得H2SO4和N4（CH2）6的量，可推算出（NH4）2SO4的含量，其計(jì)算公式如下：

式中：W2為（NH4）2SO4在兩相中的含量，g；V為所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，1 mol/L。

1.3.3 PEG含量的測(cè)定[17]

PEG含量的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[17]，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 豬胰α-淀粉酶粗酶液的制備[18]

取解凍后除去雜質(zhì)的豬胰臟50.0 g，剪碎，加50 mL pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液，于均質(zhì)機(jī)中常溫下2 000 r/min均質(zhì)5 min，紗布過濾，所得濾液即為α-淀粉酶粗酶液。

1.3.5 豬胰α-淀粉酶酶活力的測(cè)定[19]

將0.5 mL粗酶液加入到0.5 mL 1%可溶性淀粉-磷酸鈉緩沖液（20 mmol/L，pH 6.9）中，在25 ℃水浴中反應(yīng)3 min，立即加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑顯色，用DNS法測(cè)定還原糖含量。

酶活力單位定義[20]：在一定條件下，1 min催化產(chǎn)1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系的制備[21]

將不同分子質(zhì)量的PEG和（NH4）2SO4分別溶于蒸餾水，分別制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的PEG原溶液和（NH4）2SO4原溶液。準(zhǔn)確稱取2 mL的PEG原溶液，加入10 mL的刻度試管中，緩慢滴加（NH4）2SO4原溶液，邊滴加邊振蕩混勻，直至試管出現(xiàn)混濁為止，記錄已加入（NH4）2SO4原溶液的體積，計(jì)算得加入（NH4）2SO4的質(zhì)量。然后加入0.5 mL的ddH2O，使體系變澄清。重復(fù)上述步驟，計(jì)算每次體系達(dá)到混濁時(shí)（NH4）2SO4和PEG在總體系中的質(zhì)量百分比，以PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，得出PEG/（NH4）2SO4雙節(jié)線圖。

固定體系總質(zhì)量為10 g（其中粗酶液為5 g，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG溶液和（NH4）2SO4溶液共5 g）輕微振蕩混勻后靜置15 min，分相后根據(jù)試管上的刻度讀出上下相的體積（Vt和Vb），用吸管吸取上相和下相液體各1 mL于10 mL的刻度試管中，測(cè)出相比和上下相酶活，相比、胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的計(jì)算公式如下：[22]

式中：Vt、Vb分別為上下相體積，mL。

胰α-淀粉酶分配系數(shù)

式中：Ct、Cb分別為上下相分配物質(zhì)濃度，mol/L。

式中：R為相比；Ka為胰α-淀粉酶的分配系數(shù)；Y為萃取率，%。

1.3.7 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，pH值為7.0，酶液體積5 mL，分別選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、10%、12%、14%、16%、18%的（NH4）2SO4組成雙水相體系，測(cè)定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.8 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，pH值為7.0，酶液體積5 mL，選取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG組成雙水相體系，測(cè)定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.9 pH值對(duì)胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定PEG和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不變，酶液體積5 mL，分別選取pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0組成雙水相體系，測(cè)定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.10 雙水相法萃取分離豬胰α-淀粉酶體系的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化雙水相法萃取分離豬胰α-淀粉酶體系。以酶的分配系數(shù)（Ka）和萃取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值等3個(gè)因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖

雙水相的形成條件以及定量關(guān)系可采用相圖的方式表現(xiàn)出來。根據(jù)上下兩相中PEG與（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可在PEG/（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖中得到幾個(gè)不同的點(diǎn)，依次連接這些點(diǎn)可得到一條順滑的曲線，即為PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖。分別選用PEG400、PEG1500、PEG4000和（NH4）2SO4溶液作為雙水相體系支撐物質(zhì)作雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖，結(jié)果見圖1。

圖1 PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖Fig.1 Binodal curves of PEG/(NH4)2SO4aqueous two phase system

由于高聚物的不相容性和硫酸鹽的鹽析作用，一定濃度的PEG與（NH4）2SO4溶液會(huì)在水中形成兩相。由圖1可知，PEG分子質(zhì)量越大，其雙節(jié)線的形狀就越不對(duì)稱，這是因?yàn)橥活惥酆衔锏氖杷噪S分子質(zhì)量的增大而增強(qiáng)[23]，當(dāng)聚合物的分子質(zhì)量減小時(shí)，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。同時(shí)VAIDYA B K等[24]認(rèn)為小分子質(zhì)量的PEG對(duì)蛋白質(zhì)的選擇較差，不適合分離。胰α-淀粉酶主要分配在雙水相體系中的上相，由圖1可知，PEG4000形成分相所需的PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，由于高聚物的不相容性，會(huì)造成胰α-淀粉酶在上相中的分配率過低。而PEG400由于分子質(zhì)量過小，會(huì)導(dǎo)致核酸及其他雜蛋白在上相的溶解度增加。因此本試驗(yàn)選擇PEG1500作為雙水相系統(tǒng)的組成成分。

2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨對(duì)胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effects of different concentration of (NH4)2SO4on partition coefficient and extraction rate

由圖2可知，固定PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，同時(shí)調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)pH值為7，在（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%～12%，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，酶的分配系數(shù)也隨之增加。當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，分配系數(shù)Ka達(dá)到最高值5.33；之后隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，分配系數(shù)又逐漸下降。同時(shí)萃取率是隨著（（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而呈總體下降趨勢(shì)，因此選用分配系數(shù)較大時(shí)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

此外，由于分配系數(shù)均＞1，可見胰α-淀粉酶主要分配在上相[25]。大部分不溶性雜質(zhì)（結(jié)構(gòu)組織蛋白、脂肪等）主要分配在兩相之間，通過離心即可除去。

2.3 PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

圖3 PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effects of different concentration of PEG1500 on partition coefficient and extraction rate

在固定（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，同時(shí)調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)的pH值為7.0，研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG對(duì)胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，酶的分配系數(shù)和萃取率均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，分配系數(shù)Ka和萃取率Y都達(dá)到最大值分別為4.88和66.7%；隨著PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，其疏水性越來越高，從而導(dǎo)致胰α-淀粉酶向下相轉(zhuǎn)移，分配系數(shù)和萃取率開始呈下降趨勢(shì)[26]。因此選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的PEG1500進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 pH值對(duì)胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

在固定PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，研究不同pH值對(duì)胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.4 Effects of pH on partition coefficient and extraction rate

雙水相體系中pH值的變化對(duì)于胰α-淀粉酶在兩相中的分配行為影響極大，體系的pH值偏離目的蛋白胰α-淀粉酶的等電點(diǎn)太遠(yuǎn)（pH值過大或過小），均會(huì)造成胰淀粉酶活性損失，從而影響酶的分配系數(shù)和萃取率。pH值變化可影響雙水相系統(tǒng)中的硫酸鹽的解離度，從而導(dǎo)致上相跟下相之間的電位差發(fā)生改變，最終使得胰α-淀粉酶在雙水相體系中的分配行為發(fā)生改變[27]。

由圖4可知，隨著pH值的增大，分配系數(shù)和萃取率都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并且在pH值為7.0時(shí)都達(dá)到最大值分別為6.01和79.20%。因此，選用pH值為7.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 雙水相萃取胰α-淀粉酶的正交優(yōu)化試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化雙水相萃取條件，設(shè)定（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為A，PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為B，pH值為C，分別以酶的分配系數(shù)（Ka）和萃取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1和表2。

由表1可知，因素對(duì)分配系數(shù)和萃取率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值，以分配系數(shù)和萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最優(yōu)條件均為A2B2C2，即（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，pH值為7.0。在此最佳條件下對(duì)豬胰α-淀粉酶進(jìn)行雙水相萃取驗(yàn)證試驗(yàn)，其分配系數(shù)和萃取率分別達(dá)到8.48和80.25%，α-淀粉酶活為1 690 U/mL。

表1 萃取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)的影響達(dá)到顯著水平，對(duì)萃取率的影響達(dá)到了極顯著的水平。PEG1500質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配系數(shù)的影響不顯著，但對(duì)萃取率的影響達(dá)到顯著水平。pH值對(duì)分配系數(shù)和萃取率的影響均不顯著。

3 結(jié)論

本研究通過正交試驗(yàn)確定雙水相體系萃取條件為12%（NH4）2SO4，18%PEG1500，pH值為7.0時(shí)，對(duì)胰α-淀粉酶的萃取效果最好，其分配系數(shù)Ka和萃取率Y分別為8.48和80.25%，α-淀粉酶活為1 690 U/mL。該方法胰α-淀粉酶酶活損失較少，萃取率高，可為胰α-淀粉酶分離純化提供借鑒。

[1]楊東來，高學(xué)軍.豬胰淀粉酶的制備工藝研究[J].藥物生物技術(shù)，2006，13（3）：211-213.

[2]閔玉濤，宋彥顯，徐鳳才.豬胰臟淀粉酶的提取、部分純化與性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（1）：169-172.

[3]BASKIR J N,HATTON T A,SUTER U W.Protein partitioning in two-phase aqueous systems[J].Biotechnol Bioeng,1989,34(6):541-558.

[4]謝藍(lán)華，杜 冰，張嘉怡，等.雙水相萃取技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品機(jī)械，2012，28（5）：234-238.

[5]楊利民，呂金萍，馮 妍.蒲公英總黃酮在聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系中的分配與提取[J].化工進(jìn)展，2014，33（8）：1992-1997.

[6]孫亞莉，張喜峰.雙水相萃取分離紅豆蛋白質(zhì)[J].中國(guó)釀造，2013，32（6）：114-118.

[7]杜學(xué)敏，武金霞，張賀迎，等.雙水相提取糖化酶的研究[J].中國(guó)釀造，2007，26（1）：7-9，49.

[8]孫亞莉，張 瑾，裴淑平.雙水相體系分離葡萄籽多糖[J].中國(guó)釀造，2013，32（7）：89-93.

[9]ZHI W B,DENG Q Y,SONG J N,et al.One-step purification of α-amylase from the cultivation supernatant of recombinantBacillus subtilisby high-speed counter-current chromatography with aqueous polymer twophase systems[J].J Chromatogr A,2005,1070(1-2):215-219.

[10]LI M,PEEPLES T L.Purification of hyperthermophilic archaeal amylolytic enzyme(MJA1)using thermoseparating aqueous two-phase systems[J].J Chromatogr B,2004,807(1):69-74.

[11]ALBERTSSON P A.Chromatography and partition of cells and cell fragments[J].Nature,1956,177:771-774.

[12]HUSTEDT H,KRONERK H,MENGE U,et al.Protein recovery using aqueous two-phase systems[J].Trends Biotechnol,1985,31(6):139.

[13]楊基礎(chǔ)，沈忠耀，汪家鼎.用聚乙二醇/磷酸鹽雙水相體系從枯草桿菌發(fā)酵液中提取α-淀粉酶[J].清華大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，27（3）：81-89.

[14]郅文波，顧 銘，宋江楠.PEG-檸檬酸鹽雙水相體系純化α-淀粉酶及模型構(gòu)建[J].生物加工過程，2004，2（1）：47-52.

[15]馬松梅，柳明珠.丙烯酸鹽與丙烯酰胺共聚制備耐鹽性高吸水樹脂[J].功能高分子學(xué)報(bào)，2003，16（4）：502-506.

[16]凌家儉，王 寧，王林濤.高活性α-淀粉酶的分離與純化[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：930-932.

[17]李 波，蘆 菲，張軍合.雙水相萃取法分離純化α-淀粉酶的研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（8）：77-79.

[18]魏文毅，張麗萍，王 琴，等.豬胰臟中胰酶的制備新工藝技術(shù)研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，23（1）：72-78.

[19]陳 波.產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其酶學(xué)的性質(zhì)研究[D].南京：南京工業(yè)大學(xué)碩士論文，2004.

[20]曾東方，楊 帆，聶歡歡.DNS 法對(duì)食用菌發(fā)酵液淀粉酶活力的測(cè)定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011，40（11）：16-18.

[21]李 勃，黨 永，馬 瑜，等.耐酸性α-淀粉酶的分離純化提取及性質(zhì)研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38（3）：435-438.

[22]涂紹勇，李 路，楊愛華，等.雙水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，32（9）：220-222.

[23]曹軍衛(wèi)，馬輝文.微生物工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[24]VAIDYA B K,SUTHAR H K,KASTURE S,et al.Purification of potato polyphenol oxidase (PPO)by partitioning in aqueous two-phase system[J].Biochem Eng J,2006,28(2):161-166.

[25]房耀維，劉 姝，呂明生.雙水相萃取法分離低溫α-淀粉酶的研究[J].食品科學(xué)，2009，30（18）：159-162.

[26]董海莉，平文祥，葛菁萍.雙水相法萃取分離α-淀粉酶體系的初步研究[J].黑龍江大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（3）：378-382.

[27]周紅航，王維香.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶[J].化工進(jìn)展，2009，28（2）：305-309.