譚文溢，聶乾忠，管 維

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；2.湖南省南岳衡山國家級自然保護區(qū)管理局，湖南 衡陽 421900）

0 引言

中國是漁業(yè)大國，淡水魚的產(chǎn)量豐富，其中草魚產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的90%以上.但我國在水產(chǎn)開發(fā)和加工方面仍與世界水平有較大差距[1].魚鱗是魚加工過程中產(chǎn)生的主要下腳料之一，我國每年因加工所產(chǎn)生的魚鱗高達65 余萬t，往往被當(dāng)作廢棄物處理掉，造成了極大的資源浪費[2].

鈣是人體中不可缺少的礦物質(zhì)元素，鈣的缺乏容易引起骨質(zhì)疏松癥、佝僂病、骨質(zhì)軟化癥等疾病[3].檸檬酸-蘋果酸鈣又名果酸鈣，是檸檬酸和蘋果酸與鈣離子復(fù)合構(gòu)成的鈣鹽[4].檸檬酸-蘋果酸鈣較其他鈣鹽，在溶解性、吸收性等技術(shù)指標(biāo)上更優(yōu)，安全無毒，風(fēng)味良好，應(yīng)用更加廣泛[5].

草魚魚鱗中鈣的主要存在形式是羥基磷灰石，占魚鱗質(zhì)量的30%～50%[6].筆者以草魚魚鱗為原料，研究了檸檬酸-蘋果酸有機混合酸提取魚鱗中鈣的最佳工藝條件，提高了草魚魚鱗資源的利用率，為實際生產(chǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草魚魚鱗：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生鮮市場；檸檬酸、蘋果酸、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、鉻黑T、三乙醇胺：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2 型恒溫水浴鍋：常州中捷實驗儀器制造有限公司；TP-5200B 型電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；101-1A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PIB02 型電爐：奔騰電器有限公司；ZN-400A 型組織搗碎機：長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠.

1.3 試驗方案

1.3.1 原料預(yù)處理

將草魚魚鱗用水沖洗干凈，清除黏附在魚鱗表面上的魚肉和血污等雜質(zhì)，烘干后用組織搗碎機搗碎備用.

1.3.2 魚鱗鈣提取單因素試驗

分別以液料比（V/M）、溫度、檸檬酸和蘋果酸的質(zhì)量比進行單因素試驗，觀察并分析試驗的結(jié)果，考察各個因素對鈣提取率的影響，從而確定各個因素的適宜區(qū)間.

1.3.3 浸酸液中鈣含量的測定

采用EDTA 滴定法[7].分別取1、2、3、4、6、8、10 mL 的氯化鈣溶液于50 mL 的三角瓶中，均用蒸餾水定容至10 mL.分別在待測溶液中加入3 mL三乙醇胺溶液、5 mL 氨性溶液（NH3-NH4Cl 緩沖溶液）和兩滴鉻黑-T 指示劑，然后以EDTA 的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫色變成藍色，以EDTA 滴定體積和鈣濃度作圖，得到鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程：C=0.843 0V+0.121 2，其中，C 為鈣離子濃度，V 為EDTA 溶液的滴定體積.

取1 mL 浸酸液加入9 mL 水，分別加入3 mL三乙醇胺、5 mL 氨性溶液（NH3-NH4Cl 緩沖溶液）和兩滴鉻黑-T，以標(biāo)準(zhǔn)EDTA 溶液滴定至溶液由紫色轉(zhuǎn)為藍色.再根據(jù)鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算浸酸液中鈣的含量，同時做空白試驗.

1.3.4 鈣提取率的計算

1.3.5 草魚魚鱗有機酸鈣提取的二次回歸正交試驗

采用Box-Behnken 模型，以料液比、溫度、檸檬酸和蘋果酸的質(zhì)量比3 個因素為自變量，試驗因素編碼及水平見表1.

表1 試驗因素編碼及水平Table1 Code and level of factors for the trail

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對鈣提取率的影響

固定酸濃度為8%，反應(yīng)時間為6 h，提取溫度為50 ℃，蘋果酸和檸檬酸質(zhì)量比為1∶1，設(shè)定料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，測定料液比對鈣提取率的影響，結(jié)果見圖1.

圖1 料液比對鈣提取率的影響Fig.1 Effect of the liquid to material ratio on the extraction rate of calcium

由圖1 可以看出，隨著料液比的增大，鈣提取率增大，在料液比小于1∶15 時，鈣提取率的增加較為顯著，而在達到1∶15 之后，趨勢較為平緩，提取率沒有明顯變化.浸酸液比例較大時，魚鱗能與浸酸液充分接觸，鈣的提取效果較好，而浸酸液比例較小時，鈣提取效果較差，這是由于浸酸過程中伴隨著少量蛋白類物質(zhì)溶出，浸酸液少的情況下溶液黏度提升更為明顯，不利于魚鱗與浸酸液充分接觸反應(yīng)，影響了鈣的提取，這與黃煜等[8]的研究結(jié)果相同.綜合考慮，選取以1∶15 為中心的區(qū)間進行響應(yīng)面優(yōu)化.

2.1.2 溫度對鈣提取率的影響

固定酸濃度為8%，反應(yīng)時間為6 h，料液比為1∶15，蘋果酸和檸檬酸質(zhì)量比為1∶1，設(shè)定提取溫度為50、60、70、80 ℃，測定提取溫度對鈣提取率的影響，結(jié)果見圖2.

圖2 溫度對鈣提取率的影響Fig.2 Effect of the temperature on the extraction rate of calcium

由圖2 可以看出，隨著提取溫度的升高，鈣提取率逐漸增大，當(dāng)溫度超過60 ℃時，鈣提取略微降低.可能由于有機酸的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致與魚鱗反應(yīng)的酸溶液減少，從而影響了鈣提取，所以選擇以60 ℃為中心的溫度區(qū)間進行響應(yīng)面優(yōu)化.

2.1.3 檸檬酸和蘋果酸的質(zhì)量比對鈣提取率的影響固定酸濃度為8%，反應(yīng)時間為6 h，料液比為1∶15，溫度為50 ℃，設(shè)定蘋果酸與檸檬酸的質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2 和1∶3，測定酸配比對鈣提取率的影響，結(jié)果見圖3.

圖3 蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比對鈣提取率的影響Fig.3 Effect of the malic acid to citric acid ratio on the extraction rate of calcium

由圖3 可以看出，在蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比為1∶1 時，鈣提取率最高，不同的蘋果酸與檸檬酸配比提取的鈣鹽組分不同，而檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽更易溶出，為了進一步提高鈣提取率，選擇以蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比1∶1 為中心的區(qū)間進行響應(yīng)面優(yōu)化.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

中心組合試驗的試驗方案以及試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3，回歸模型各影響系數(shù)項的顯著性檢驗結(jié)果見表4.

表2 試驗結(jié)果Table 2 Experiment result

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression coefficient

通過Design Expert 8.0 對表2 的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，建立鈣提取率（Y）的二次響應(yīng)面回歸模型，得到的鈣提取率（Y）對自變量液料比（X1）、溫度（X2）、蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比（X3）的回歸方程為：Y=8.24+0.32X1+0.039X2+0.12X3+0.25X1X2-0.66X1X3-0.097X2X3-0.35X12-1.18X22-0.49X32.

由表3 可知，交互項的概率為0.504 3（＞0.05），說明交互項對鈣提取率的影響不顯著；二次項和總模型的概率小于0.000 1，說明二次項對鈣提取率的影響極其顯著，且此總模型極其顯著；失擬項F 值為5.03（＜F0.05），P 值為0.088 0（＞0.05），說明模型的擬合度較好，失擬項不顯著，試驗的誤差較小.

由表4 可知，對鈣提取率影響極其顯著的因子為料液比（P=0.000 3＜0.01），影響顯著的因子為蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比（P=0.042 8＜0.05），影響不顯著的因子為溫度（P=0.442 1＞0.05）.

2.3 響應(yīng)面分析（圖4—圖6）

圖4 液料比和溫度對鈣提取率的影響Fig.4 Effect of the liquid to material ratio and temperature on the extraction rate of calcium

圖5 液料比和蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比對鈣提取率的影響Fig.5 Effect of the liquid to material ratio and the mass ratio of malic acid to citric acid on the extraction rate of calcium

圖6 溫度和蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比對鈣提取率的影響Fig.6 Effect of the mass ratio of malic acid to citric acid and temperature on the extraction rate of calcium

由圖4 可以看出，圖中等高線的形狀略呈扁平狀，表示溫度和液料比交互作用顯著[9].在相同液料比下，隨著溫度的升高，鈣提取率先升后降，這是因為魚鱗中的鈣在反應(yīng)中以蘋果酸鈣、檸檬酸鈣、檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣的形式溶出，溫度過高會導(dǎo)致鈣鹽的水溶性下降，隨著溫度的升高，化學(xué)反應(yīng)速率加快，檸檬酸由于熱穩(wěn)定性較低，會發(fā)生其他化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，降低了鈣提取率.這與劉洪玲等[10]研究結(jié)論中關(guān)于提取溫度的試驗數(shù)據(jù)的趨勢是相同的.相同溫度下，鈣提取率隨著液料比的增大而提高，最后趨近一個定值，反應(yīng)趨于完全.

由圖5 可以看出，圖中等高線的形狀呈扁平狀，表示蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比和液料比的交互作用對鈣提取率的影響較為顯著.不同的液料比下，蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比的最優(yōu)水平不同，可能由于提取的鈣為檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽，而目前尚未完全定義其化學(xué)分子式，有機酸的反應(yīng)也較為復(fù)雜，還需進行更深一步的試驗探究.李淑芳等[11]提出了對檸檬酸-蘋果酸鈣分子式的假設(shè)并初步證明了其組分中蘋果酸根與檸檬酸根的物質(zhì)的量的比為2∶1，換算成質(zhì)量比與本試驗得出的最優(yōu)水平相接近.

由圖6 可以看出，圖中等高線的形狀呈橢圓形，但較為偏向圓形，表示溫度和蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比的相互作用對鈣提取率的影響不顯著.在相同溫度下，鈣提取率隨著蘋果酸在混酸中比例的增加先升后降，這是由于高鈣提取率時對應(yīng)的酸的配比能夠產(chǎn)生較多的檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽，而復(fù)合鈣鹽的水溶性是強于檸檬酸鈣和蘋果酸鈣的，同時蘋果酸的酸性強于檸檬酸，蘋果酸鈣的水溶性也強于檸檬酸鈣，所以鈣提取率呈先升后降的趨勢.

3 結(jié)論

（1）根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計進行試驗得出的結(jié)果表明，利用檸檬酸和蘋果酸提取草魚魚鱗中可溶性鈣的最佳工藝條件為：液料比為18.5∶1，提取溫度為61 ℃，蘋果酸與檸檬酸的質(zhì)量比為1.1∶1.

（2）經(jīng)試驗驗證，上述工藝條件下，鈣提取率為8.56%，與理論的預(yù)測值8.42%非常接近，試驗值與理論值吻合較好，該模型可靠性較高.

（3）由顯著性檢驗和響應(yīng)面分析可知，液料比對鈣提取的影響極其顯著，溫度對鈣提取率的影響不顯著，蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比對鈣提取率的影響顯著.液料比和溫度的交互作用對鈣提取率的影響顯著，液料比和蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比的交互作用對鈣提取率的影響極其顯著，溫度和蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比的交互作用對鈣提取率的影響不顯著.

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