王云龍，胡俊峰，李玉林，王繼創(chuàng)，程 蕾

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450001）

0 前言

降鈣素原（PCT）編碼基因定位于人類(lèi)第11 號(hào)染色體，該基因由6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子組成，總長(zhǎng)約7 600 bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為2 800 bp.基因轉(zhuǎn)錄后在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)翻譯成降鈣素原前體，進(jìn)而在內(nèi)源多肽酶的作用下修飾加工，生成116 個(gè)氨基酸的終產(chǎn)物PCT[1].PCT可由細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶分解生成降鈣素，這種肽類(lèi)激素對(duì)人體有重要的調(diào)節(jié)作用.正常情況下，PCT 在血清中的含量非常低，僅為10～50 pg/mL，然而在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎等細(xì)菌性感染的患者血清中PCT水平顯著升高，其濃度可達(dá)正常水平的幾千倍甚至上萬(wàn)倍，而在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥等患者的血清中PCT 濃度不增加或輕微增加，這就決定了PCT 相較于其他血清標(biāo)志物而言具有高度的特異性[2]，可作為細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)，用于細(xì)菌類(lèi)疾病的鑒別診斷[3]，為醫(yī)生是否使用抗生素提供有價(jià)值的參考.不僅如此，由于PCT的濃度和疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，并隨著病情的發(fā)展變化而變化，因此PCT 又可作為判斷病情與愈后以及療效觀察的可靠指標(biāo)[4]，醫(yī)生可以通過(guò)監(jiān)測(cè)PCT 的變化從而觀察抗生素的治療效果，使患者及時(shí)得到針對(duì)性治療，縮短治療周期、減少治療費(fèi)用[5]，因此早期PCT 的定量檢測(cè)臨床意義重大，也正是開(kāi)展本研究的目的所在.與其他PCT 檢測(cè)方法相比，ELISA 酶免檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性、成本低、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)污染[6]，可在大多數(shù)基層醫(yī)院使用[7].因此本研究制備了PCT 高特異性的單克隆抗體并且建立了PCT 的雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法.

1 材料和方法

1.1 材料

PCT 抗原以及PCT 酶標(biāo)抗體由河南省生物技術(shù)研究中心提供；47 份細(xì)菌感染血清標(biāo)本、38 份健康人血清標(biāo)本、50 份PCT 臨床陽(yáng)性血清標(biāo)本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院鑒定（羅氏電化學(xué)發(fā)光法）并提供；PCT 線(xiàn)性參考品（P1=10 ng/mL、P2=5 ng/mL、P3=2 ng/mL、P4=1 ng/mL、P5=0.5 ng/mL）.精密性質(zhì)控品為6 ng/mL 均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，所有標(biāo)本無(wú)溶血、常規(guī)傳染?。℉N、HCV、HBV）檢測(cè)陰性；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 PCT 單克隆抗體的制備

選取6～8 周齡，體質(zhì)量17～21 g 的Balb/c 小鼠，每只小鼠分別經(jīng)皮下多點(diǎn)注射PCT 抗原混合等體積的弗氏完全佐劑.首次免疫4 周后進(jìn)行第二次免疫，加等體積的弗氏不完全佐劑，7 d 后再加強(qiáng)免疫一次.然后取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株sp2/0 細(xì)胞按常規(guī)方法融合，經(jīng)間接ELISA 篩選，有限稀釋法獲得單克隆化細(xì)胞株后，按常規(guī)方法制備腹水從而制備大量的PCT 單克隆抗體[8].

1.2.2 PCT 單克隆抗體的特性鑒定

使用Western-blot 法，取PCT 抗原進(jìn)行SDSPAGE，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉，依次滴加雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清及HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，顯色后觀察是否有特異性條帶.

1.2.3 PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 包被液的選擇及條件優(yōu)化

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)選用常用的0.01 mol/L PB（pH7.2）、0.05 mol/L CB（pH9.6）兩種包被緩沖液，分別在37 ℃和4 ℃通過(guò)不同時(shí)間包被來(lái)進(jìn)行包被條件的優(yōu)化試驗(yàn)，并得出最佳包被條件.

1.2.3.2 封閉液的選擇及條件優(yōu)化

封閉液的選擇：選用常用的0.3%BSA、0.6%BSA、1%BSA 3 種不同濃度進(jìn)行對(duì)比；封閉時(shí)間及溫度的選擇：37 ℃下1、2、4 h；4 ℃下12、18、24 h.同樣用已知的線(xiàn)性參考品進(jìn)行封閉條件試驗(yàn)比較，得出最佳封閉條件.

1.2.3.3 包被抗體和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定

包被抗體濃度選擇：300、400、500 ng/mL.酶標(biāo)抗體濃度選擇：1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000.分別用線(xiàn)性參考品進(jìn)行棋盤(pán)滴定檢測(cè).

1.2.3.4 反應(yīng)模式和反應(yīng)時(shí)間的確定

選用兩步法模式，在兩步法中選擇模式一（30 min+30 min+20 min）、模式二（60 min+30 min+20 min）、模式三（60 min+60 min+20 min）3 種方式進(jìn)行試驗(yàn).用已知線(xiàn)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果分析確定最佳反應(yīng)模式.

1.2.3.5 線(xiàn)性考察

通過(guò)已建立的PCT 檢測(cè)方法對(duì)線(xiàn)性參考品進(jìn)行檢測(cè).以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)y，參考品濃度為橫坐標(biāo)x，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.2.4 臨床樣品考核

1.2.4.1 靈敏度和特異性的試驗(yàn)

用已建立的方法來(lái)檢測(cè)136 份細(xì)菌性感染病人血清和90 份病毒性感染病人血清，通過(guò)結(jié)果來(lái)考察本方法的靈敏度和特異性.

1.2.4.2 臨床標(biāo)本對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)

羅氏PCT 試劑盒作為本檢測(cè)方法的參照試劑盒，用建立的ELISA 雙抗體夾心檢測(cè)方法與羅氏PCT 試劑盒對(duì)比檢測(cè)50 份PCT 定值血清標(biāo)本，評(píng)價(jià)制備的PCT 雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法.

2 結(jié)果與討論

2.1 PCT 單克隆抗體的制備和鑒定

經(jīng)細(xì)胞融合、篩選及克隆化，獲得8 株能穩(wěn)定分泌抗PCT mAb 的雜交瘤細(xì)胞株，Westem-blot 顯示，所有雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清能同時(shí)檢測(cè)到PCT 抗體，表明這8 株單克隆抗體可特異地識(shí)別PCT.

2.2 包被液的選擇及條件優(yōu)化

表1 顯示：當(dāng)包被液選擇用0.05 mol/L pH 9.6 的CB 緩沖液時(shí)其R2值及P5 檢測(cè)值均高于0.01 mol/L 的pH7.2 的PB 緩沖液.而且包被的溫度和時(shí)間設(shè)定為4 ℃下包被12 h 要優(yōu)于37 ℃下包被4 h.因此最終確定0.05 mol/L，pH9.6 的CB緩沖液在4 ℃條件下包被12 h 最有利于PCT 的檢測(cè).

表1 不同包被條件下血清樣品檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of serum samples coated under different conditions

包被液的pH、離子強(qiáng)度、包被反應(yīng)時(shí)間及包被環(huán)境溫度的不同會(huì)影響固相載體對(duì)蛋白的吸附能力.由表1 可以看出，包被緩沖液偏堿性有利于該抗體與包被板的吸附.包被時(shí)間過(guò)短不利于包被抗體的吸附.包被溫度選擇上，低溫和高溫的結(jié)果雖然相近，但是高溫可能會(huì)對(duì)包被抗體的活性造成的影響是試驗(yàn)中必須考慮的因素.從生產(chǎn)工藝上考慮，4 ℃包被12 h，包被間隔期可以選擇晚上，不會(huì)影響生產(chǎn)進(jìn)度，所以選擇低溫包被12 h.

2.3 封閉液的選擇及條件優(yōu)化

由表2 可以看出，用0.6% BSA 在37 ℃下封閉2 h 其R2值（0.996 8）及P5 檢測(cè)值（0.123）符合要求，能夠有效封閉包被板中未被目標(biāo)抗體結(jié)合的蛋白位點(diǎn)，避免假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn).因此研究選擇封閉條件為0.6% BSA 在37 ℃下封閉2 h.

表2 不同封閉條件下血清樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of serum samples closured under different conditions

根據(jù)表2 選擇了37 ℃下封閉2 h，原因一：37℃下的R2和P5 值都較好，符合試驗(yàn)要求.原因二：時(shí)間上可以大幅減少，試驗(yàn)進(jìn)度不會(huì)拉長(zhǎng).原因三：封閉完成之后緊接著就進(jìn)行下一步的試驗(yàn)或者存冷庫(kù)保存，抗體活性與4 ℃下相比幾乎沒(méi)有區(qū)別.

2.4 最佳抗體包被濃度和酶標(biāo)濃度的確定

表3 結(jié)果顯示：400 ng/mL 的抗體包被濃度與1∶8 000 酶標(biāo)二抗?jié)舛扰鋵?duì)效果最好，其檢測(cè)結(jié)果P5=0.148，R2=0.993 5，滿(mǎn)足試驗(yàn)要求.因此選擇最佳的包被抗體濃度為400 ng/mL，最佳酶標(biāo)抗體濃度為1∶8 000.

表3 不同樣品稀釋度條件下血清樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of serum samples diluted under different conditions

2.5 反應(yīng)模式和反應(yīng)時(shí)間的確定

由表4 可知，兩步法線(xiàn)性關(guān)系良好，模式一的反應(yīng)模式線(xiàn)性范圍更寬，R2＞0.98，符合研究要求，并在總體上檢測(cè)時(shí)間比其他模式所需要的時(shí)間更少.因此，綜合判斷結(jié)果，將模式一作為本研究的檢測(cè)模式.

表4 不同反應(yīng)模式下血清樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of serum samples under different response modes

由表4 可知，雖然模式二和模式三的線(xiàn)性也符合試驗(yàn)要求，但是在確保標(biāo)準(zhǔn)品P5 檢出值符合要求的前提下，綜合3 種模式的檢測(cè)線(xiàn)性范圍，模式一的線(xiàn)性范圍更寬，而且模式一在整體檢測(cè)時(shí)間上得以縮短，只需要90 min，提高了檢測(cè)的效率，因此選擇模式一.

2.6 線(xiàn)性考察結(jié)果

通過(guò)建立起的線(xiàn)性參考品繪制曲線(xiàn)（圖1）可見(jiàn)，PCT 濃度在0.5～10 ng/mL 范圍中呈線(xiàn)性關(guān)系，R2≥0.98 符合試驗(yàn)要求.

圖1 PCT 線(xiàn)性曲線(xiàn)Fig.1 PCT linear diagram

2.7 臨床靈敏度和臨床特異性

使用本研究中建立的PCT 雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法檢測(cè)136 例臨床確診為細(xì)菌感染性疾病的患者，136 例檢測(cè)結(jié)果PCT 大于2 ng/mL，靈敏度達(dá)到95.6%，另外檢測(cè)90 例病毒感染血清，88例呈陰性，特異性為97.8%，結(jié)果見(jiàn)表5.

由表5 可以看出，在陽(yáng)性臨床血清檢測(cè)中本PCT 酶免檢測(cè)方法的靈敏度達(dá)到95.6%，在陰性臨床血清檢測(cè)中特異性達(dá)到了97.8%，因而本試驗(yàn)建立的方法在臨床檢測(cè)中具有較高的敏感性和特異性.

2.8 臨床標(biāo)本對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)

與羅氏試劑盒對(duì)比，驗(yàn)證本研究中建立的PCT雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法的檢測(cè)效果.將大于10 ng/mL 含量的血清按一定比例倍比稀釋后分別用這兩種方法進(jìn)行檢測(cè).

表5 PCT 定量檢測(cè)方法的靈敏度和特異性分析Table 5 The sensitivity and specificity of the quantitative method of PCT

圖2 相關(guān)性對(duì)比檢測(cè)曲線(xiàn)Fig.2 Linear diagram of the correlation results

圖2 結(jié)果顯示，R2值為0.967 0，二者相關(guān)性良好，本試驗(yàn)建立的PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法達(dá)到了較高的水平.

臨床上抗生素的合理應(yīng)用是人們十分關(guān)注的問(wèn)題.抗生素的濫用不僅對(duì)病情治療毫無(wú)幫助，反而會(huì)延誤病情，對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，增加細(xì)菌耐藥性，加重病情甚至造成二重感染[9]，而多數(shù)醫(yī)生在抗生素應(yīng)用上依靠自身經(jīng)驗(yàn)[10]，因缺乏客觀指標(biāo)往往很難把握.PCT 作為細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)[11]，不僅可以作為是否使用抗生素的參考指標(biāo)和依據(jù)，還可以通過(guò)監(jiān)測(cè)病人PCT 的變化從而觀察抗生素的治療成效，給抗生素的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)[12].因此，建立靈敏特異，可靠性強(qiáng)的PCT 血清學(xué)定量檢測(cè)方法尤其重要.

本試驗(yàn)室通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)建立了PCT 定量檢測(cè)方法.與PCT 膠體金檢測(cè)技術(shù)相比，克服了膠體金技術(shù)不能定量檢測(cè)血液中PCT 含量的缺點(diǎn)，PCT 酶免檢測(cè)技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)血液中PCT 含量，并能夠監(jiān)測(cè)PCT 含量的變化情況，給臨床診斷提供可靠的依據(jù).與PCT 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相比，PCT 酶免檢測(cè)方法成本低，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求不高，能夠滿(mǎn)足大多數(shù)基層醫(yī)院的需求.

3 結(jié)論

本研究制備了PCT 特異性的單克隆抗體進(jìn)而建立了基于ELISA 的PCT 定量檢測(cè)方法.經(jīng)試驗(yàn)確定的反應(yīng)條件和參數(shù)為：包被液選擇4 ℃下pH 9.6 的0.05 mol/L CB 包被12 h，封閉液選擇37 ℃下0.6%BSA 封閉2 h，包被濃度為400 ng/mL，酶標(biāo)濃度為1∶8 000，所能定量的線(xiàn)性范圍為0.5～10 ng/mL，靈敏度95.6%，特異性97.8%.該方法與羅氏試劑盒對(duì)比檢測(cè)的結(jié)果顯示兩者相關(guān)性R2=0.967 0.所以本研究建立的PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值.

［1］Menendez R，Cavalcanti M，Reyes S，et al.Markers of treatment failure in hospitalired community acquird pneunmonia［J］.Thorsx，2008，63（5）:447-452.

［2］Bouadma L，Luyt C E，Tubach F，et al.Use of procalcitonin to reduce patients' exposure to antibiotics in intensive care units（PRORATA trial）:a multicentre randomized controlled trial［J］.Lancet，2010，375（9713）:463-474.

［3］朱柏珍，陳海英，沈璐，等.探討PCT、CRP、WBC 計(jì)數(shù)在抗生素合理應(yīng)用中的監(jiān)控作用［J］.今日藥學(xué)，2014,24（8）:564-576.

［4］徐愛(ài)蕾，王為.降鈣素原檢測(cè)方法學(xué)和臨床意義的研究進(jìn)展［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2012,40（1）:242-244.

［5］李世頌.關(guān)于抗生素的濫用現(xiàn)狀與對(duì)策［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2009,3（7）:181-182.

［6］Hirakata Y,Yanagihara K,Kurihara S,et al.Comparison of usefulness of plasma procalci -tonin and C-reactive protein measurements for estimation of severity in adults with commu -nity-acquired pneumonia［J］.Diagn Microbiol Infect Dis,2008，61（2）:170-174.

［7］鄧歷.降鈣素原在感染性疾病中的臨床意義［J］.職業(yè)與健康，2010,26（7）:823-824.

［8］劉琦，郭艷茹，劉瑩，等.降鈣素原抗原的表達(dá)及抗體的制備與初步鑒定［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24（8）:795-797.

［9］郭翼華，項(xiàng)嘉亮，陳榮策.血清降鈣素原對(duì)感染性休克的診斷價(jià)值［J］.中國(guó)基層醫(yī)藥，2005,12（5）:590.

［10］黃騁，邱慧寶，陳鴻恩，等.降鈣素原（PCT）在兒科感染性疾病診斷中的應(yīng)用［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007,27（1）:82-83.

［11］胡如雪.降鈣素原（PCT）的臨床應(yīng)用價(jià)值［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2005,23（3）:259.

［12］張守印，賀金榮，張雙宅，等.PCT 早期鑒別細(xì)菌和病毒感染及其在疾病控制中的應(yīng)用［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007,17（12）:2235-2237.