杜 磊，杜 楊，席菁聆

（1.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 安陽 455000）

0 引言

隨著人們健康意識(shí)的增加，保健食品日益被重視.目前，一直流行于日本人餐桌上的納豆受到全世界人們的追捧.由納豆制成的各種保健產(chǎn)品、生物制劑也很受人們歡迎.因此用于發(fā)酵納豆及納豆制品的納豆芽孢桿菌制劑亦成為人們研究的熱點(diǎn).近年來，國內(nèi)外食品科學(xué)研究者被納豆菌極高的營養(yǎng)價(jià)值所吸引，研究并開發(fā)了大量的納豆菌相關(guān)產(chǎn)品，其中以保存容易、食用方便為優(yōu)點(diǎn)的納豆菌凍干活菌制劑，市場(chǎng)銷量最大，最受廣大消費(fèi)者歡迎.但在納豆菌凍干活菌制劑的生產(chǎn)中，冷凍會(huì)對(duì)納豆芽孢桿菌造成細(xì)胞損傷、機(jī)械損傷等一系列不良影響.直接冷凍納豆芽孢桿菌菌液，會(huì)造成納豆芽孢桿菌的大量死亡，而在菌液冷凍過程中，向菌液中加入適量保護(hù)劑可減少菌體細(xì)胞的死亡.因此提高納豆芽孢桿菌冷凍存活率的關(guān)鍵在于有效保護(hù)劑的合理使用.近些年，有不少學(xué)者對(duì)相關(guān)方面進(jìn)行了研究.Kilara[1]認(rèn)為當(dāng)冷凍前菌懸液濃度越大時(shí)，單個(gè)菌體細(xì)胞暴露在介質(zhì)中的面積就越小，冷凍干燥菌種存活率就越大，此研究結(jié)果可以作為來選擇菌液與保護(hù)劑混合的濃度配比的參考.宋金慧等[2]以酶解乳清培養(yǎng)基為離心基質(zhì)，研究得出活菌存活率最高的離心條件為8 000 r/min、10 min；活菌凍干存活率最高的離心條件為4 000 r/min、10 min.胡仲秋等[3]以11%脫脂乳為液體培養(yǎng)基，以離心力、離心溫度和離心時(shí)間為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)果表明：隨著離心時(shí)間的增加，菌體離心損失率和離心存活率都減小；控制離心時(shí)間不變，增大離心力，離心損失率和離心存活率均降低，這些數(shù)據(jù)可以為離心條件提供參考.吳寶川等[4]以糖類、醇類、氨基酸類等凍干保護(hù)劑為研究對(duì)象，對(duì)其保護(hù)機(jī)制和作用對(duì)象進(jìn)行了分析.常金梅等[5]認(rèn)為控制菌種凍干過程存活率的影響因素有：菌種懸液的濃度、菌齡、培養(yǎng)基的成分、抗逆能力、凍結(jié)速度、復(fù)活處理、保護(hù)劑，優(yōu)化以上因素中的1 種或幾種，均有助于提高凍干菌種的存活率.上述研究結(jié)果可為本研究中保護(hù)劑的選擇、配比、復(fù)活速度等提供參考.曹峰[6]、胥振國[7]、鐘青萍等[8]都研究了納豆菌冷凍保護(hù)劑復(fù)合配方.綜合以上研究結(jié)果，作者選取比較成熟的保護(hù)劑如乳糖、甘露醇、麥芽糊精、L-抗壞血酸鈉、β-環(huán)糊精等為研究對(duì)象，進(jìn)行納豆菌保護(hù)劑的研究.

1 材料與方法

1.1 材料

納豆芽孢桿菌：北京川秀科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；5430R 臺(tái)式超高速離心機(jī)：艾本德中國有限公司；LDZH-100KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZWY-1102C 恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；BCD-290W 醫(yī)用冷藏箱：青島海爾股份有限公司.

1.3 方法

1.3.1 納豆菌培養(yǎng)基的制備

種子培養(yǎng)基的制備：參照GB 4789.28—2013[10].

發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：分別稱取蛋白胨30 g、葡萄糖45 g、MgSO43 g、K2HPO41.5 g、KH2PO43 g，加入1 500 mL 蒸餾水，配制成1 500 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，在高壓蒸汽滅菌器中，121 ℃滅菌20 min 后備用.

1.3.2 納豆菌菌種活化

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取100 mL 種子培養(yǎng)基，置于250 mL 三角瓶中，取適量納豆菌菌粉，接種于種子培養(yǎng)基，搖勻，將接種好的培養(yǎng)基置于150 r/min、40 ℃搖床培養(yǎng)24 h，得到種子液.重復(fù)2～3次.

1.3.3 納豆菌擴(kuò)大培養(yǎng)

按照3%接種量接種于每個(gè)三角瓶中，搖勻，將接種好的三角瓶置于180 r/min、40 ℃搖床培養(yǎng)24 h，這個(gè)時(shí)期正好是菌種的對(duì)數(shù)期.

1.3.4 納豆菌的收集

將發(fā)酵液在4 ℃下，以5 000 r/min 離心10 min，在超凈工作臺(tái)中收集菌泥，將收集好的菌泥用無菌生理鹽水稀釋至一定濃度，將稀釋好的菌懸液放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3.5 冷凍保護(hù)劑單因素試驗(yàn)

取稀釋備用的菌懸液，不加保護(hù)劑置于-20 ℃普通冰箱冷凍48 h，用稀釋涂布平板法測(cè)定冷凍后活菌數(shù)，解凍條件為：40 ℃，2 h，得出納豆菌存活率為13.30%（作為對(duì)照組）.

按表1 選取乳糖、甘露醇、麥芽糊精、L-抗壞血酸鈉、β-環(huán)糊精5 種保護(hù)劑進(jìn)行單因素試驗(yàn).將保存?zhèn)溆玫木鷳乙褐糜?7 ℃培養(yǎng)箱復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，取0.1 mL 復(fù)蘇后的菌懸液稀釋涂布平板計(jì)數(shù)，得到原始菌懸液中活菌濃度.取預(yù)先配制好的不同濃度保護(hù)劑與菌懸液，混合均勻，將混合液置于-20 ℃普通冰箱冷凍48 h，用稀釋涂布平板法測(cè)定冷凍后活菌數(shù)，用冷凍后菌體存活率來反映各單一保護(hù)劑的保護(hù)效果.

表1 單一保護(hù)劑濃度Table 1 The quality of single protective agent concentration

1.3.6 納豆菌存活率測(cè)定

采用稀釋涂布平板法測(cè)定冷凍前后保護(hù)劑菌液混合液中納豆菌活菌數(shù)，然后根據(jù)以下公式計(jì)算納豆菌的存活率：納豆菌存活率=（冷凍后每毫升菌懸液活菌數(shù)/冷凍前每毫升菌懸液活菌數(shù)）×100%.

1.3.7 冷凍保護(hù)劑的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用四因素三水平L9（34）設(shè)計(jì)正交組合優(yōu)化保護(hù)劑的配方.

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種冷凍保護(hù)劑單獨(dú)使用對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響

2.1.1 不同濃度乳糖對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響以不同濃度的乳糖為保護(hù)劑，配制保護(hù)劑菌液混合液，將混合液在-20 ℃冷凍后，測(cè)定混合液中納豆菌的存活率，結(jié)果見圖1.由圖1 可知，乳糖對(duì)納豆菌在冷凍過程中具有保護(hù)作用，0.4%的乳糖就能使納豆菌的存活率較不加保護(hù)劑的對(duì)照組增大3.06 倍，隨著乳糖濃度的增大，納豆菌的存活率也明顯提高，當(dāng)乳糖濃度為1.2%時(shí)，納豆菌的存活率達(dá)到76.72%，比不加保護(hù)劑的對(duì)照組提高60%以上.這可能是由于在冷凍過程中，乳糖通過“ 水置換作用”抑制菌體細(xì)胞膜磷脂脫水，阻止糖鏈間的范德華力增強(qiáng)，阻礙菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化，從而保護(hù)菌體不被損傷.

圖1 不同濃度乳糖對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響Fig.1 Effect of different concentration of lactose on natto fungus frozen survival rate

2.1.2 不同濃度甘露醇對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響

以不同濃度的甘露醇為保護(hù)劑，配制保護(hù)劑菌液混合液，將混合液在-20 ℃冷凍后，測(cè)定混合液中納豆菌的存活率，結(jié)果見圖2.由圖2 可知，甘露醇對(duì)納豆菌在冷凍過程中也具有保護(hù)作用.甘露醇濃度為4%時(shí)，納豆菌冷凍存活率達(dá)到67.44%，比不加保護(hù)劑的對(duì)照組增大50%以上.這是因?yàn)榫w處于低溫環(huán)境時(shí)，適宜濃度的甘露醇能夠在水中形成無定型結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，阻止細(xì)胞膜蛋白質(zhì)分子的聚集，從而保護(hù)細(xì)胞膜骨架不被損壞.當(dāng)甘露醇濃度低于或高于4%時(shí)，納豆菌冷凍存活率都降低，這是因?yàn)楦事洞荚诖藵舛葧r(shí)形成了結(jié)晶，促進(jìn)了細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的聚集，不僅起不到保護(hù)細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，反而更有利于細(xì)胞膜骨架的損壞.通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，最終選取甘露醇濃度為4%進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖2 不同濃度甘露醇對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響Fig.2 Effect of different concentration of mannitol on natto fungus frozen survival rate

2.1.3 不同濃度麥芽糊精對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響

以不同濃度的麥芽糊精為保護(hù)劑，配制保護(hù)劑菌液混合液，將混合液在-20 ℃冷凍后，測(cè)定混合液中納豆菌的存活率，結(jié)果見圖3.由圖3 可知，麥芽糊精對(duì)納豆菌在冷凍過程中也有保護(hù)作用.當(dāng)麥芽糊精的濃度為5%時(shí)，納豆菌的存活率達(dá)到69.32%，比對(duì)照組提高50%以上.這可能是因?yàn)辂溠亢旧硎且环N高分子多糖，菌液冷凍過程中適宜濃度的麥芽糊精可完全包裹菌體細(xì)胞，使菌體細(xì)胞不與外界氧氣接觸，由麥芽糊精形成的保護(hù)層保護(hù)細(xì)胞壁不被損壞，胞內(nèi)物質(zhì)不泄漏，從而提高菌液冷凍存活率.

2.1.4 不同濃度L-抗壞血酸鈉對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響

圖3 不同濃度麥芽糊精對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響Fig.3 Effect of different concentration of maltodextrin on natto fungus frozen survival rate

以不同濃度的L-抗壞血酸鈉為保護(hù)劑，配制保護(hù)劑菌液混合液，將混合液在-20 ℃冷凍后，測(cè)定混合液中納豆菌的存活率，結(jié)果見圖4.由圖4可知，L-抗壞血酸鈉對(duì)納豆菌在冷凍過程中具有很好的保護(hù)作用.L-抗壞血酸鈉濃度為2%時(shí)，納豆菌冷凍存活率高達(dá)74.34%，比不加保護(hù)劑的對(duì)照組增大60%以上.這是因?yàn)樵诶鋬鲞^程中，L-抗壞血酸鈉具有還原性，可以減少空氣中的氧對(duì)菌體的破壞，同時(shí)L-抗壞血酸鈉對(duì)菌體蛋白質(zhì)也有一定的保護(hù)作用，可降低冷凍對(duì)菌體細(xì)胞膜造成的損傷，從而提高納豆菌冷凍存活率.然而，隨著L-抗壞血酸鈉濃度的增加，納豆菌冷凍存活率反而降低.這說明，在菌液冷凍過程中并不是保護(hù)劑的濃度越大保護(hù)效果越好，而是存在一個(gè)最佳濃度.

圖4 不同濃度L-抗壞血酸鈉對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響Fig.4 Effect of different concentration of L-ascorbic acid sodium on natto fungus frozen survival rate

2.1.5 不同濃度β-環(huán)狀糊精對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響

以不同濃度的β-環(huán)狀糊精為保護(hù)劑，配制保護(hù)劑菌液混合液，將混合液在-20 ℃冷凍后，測(cè)定混合液中納豆菌的存活率，結(jié)果見圖5.由圖5 可知，以β-環(huán)狀糊精為保護(hù)劑，雖然其對(duì)納豆菌的冷凍有一定的保護(hù)作用，但是納豆菌的最大存活率僅為20.41%，比不加保護(hù)劑的對(duì)照組只增大了7%.β-環(huán)狀糊精和麥芽糊精類似，也是一種大分子多糖，然而其對(duì)菌體的保護(hù)作用遠(yuǎn)不及麥芽糊精，這可能與β-環(huán)狀糊精的結(jié)構(gòu)有關(guān)，同時(shí)其水溶性差也可能是一個(gè)重要的原因.

圖5 不同濃度β-環(huán)狀糊精對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響Fig.5 Effect of different concentration of βcyclodextrin on natto fungus frozen survival rate

2.2 冷凍保護(hù)劑正交組合優(yōu)化試驗(yàn)

為進(jìn)一步提高納豆菌冷凍后的存活率，選擇單因素中對(duì)納豆菌存活率保護(hù)效果較好的4 種保護(hù)劑：乳糖、甘露醇、麥芽糊精、L-抗壞血酸鈉進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2.

從表2 可知，乳糖對(duì)菌體的存活率影響最大，麥芽糊精次之，L-抗壞血酸鈉和甘露醇對(duì)菌體存活率影響較小，保護(hù)劑最優(yōu)組合為A2B1C1D3.即：乳糖1.2%、甘露醇3%、麥芽糊精4.5%、L-抗壞血酸鈉2.5%.而試驗(yàn)中得到的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即乳糖1.2%、甘露醇3%、麥芽糊精5%、L-抗壞血酸鈉2.5%.因此需做驗(yàn)證試驗(yàn).

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of L9（34）orthogonal experiment

通過驗(yàn)證性試驗(yàn)最終確定的納豆菌冷凍保護(hù)劑復(fù)合配方為：乳糖1.2%、甘露醇3%、麥芽糊精4.5%、L-抗壞血酸鈉2.5%.此時(shí)冷凍后菌懸液中活菌存活率為84.25%，大于各單一因素菌體的存活率.說明單一保護(hù)劑對(duì)納豆菌冷凍的保護(hù)作用較小，而保護(hù)劑復(fù)配后，相互間具有協(xié)同作用，從而大大提高冷凍過程中菌體存活率.

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)從5 種保護(hù)劑中篩選出納豆菌的有效冷凍保護(hù)劑，其中對(duì)納豆菌活菌存活率影響較大的因素為：乳糖、甘露醇、麥芽糊精、L-抗壞血酸鈉，其中乳糖對(duì)菌體存活率影響最大.這可能是由于在冷凍過程中，菌體細(xì)胞膜磷脂脫水，細(xì)胞膜中磷脂分子間，分子極性增強(qiáng)，細(xì)胞膜糖鏈間的范德華力增強(qiáng)，菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生相變，而乳糖作為冷凍保護(hù)劑可以通過“ 水置換作用”抑制細(xì)胞膜的相變，保護(hù)菌體.縱觀保護(hù)劑對(duì)納豆菌冷凍存活率的影響趨勢(shì)，隨著保護(hù)劑濃度的增加，菌體的存活率不斷提高，但達(dá)到一定濃度時(shí)，保護(hù)劑的效果達(dá)到最大值，此后再增加保護(hù)劑濃度保護(hù)效果反而降低.這說明菌粉冷凍保護(hù)劑的濃度不是越大越好，而是存在一個(gè)最佳濃度.

在冷凍保護(hù)劑的選擇上，未選用目前大多數(shù)學(xué)者所青睞的保護(hù)劑——脫脂乳粉.原因在于，盡管脫脂乳粉在納豆菌冷凍過程中保護(hù)效果明顯，但在納豆菌凍干菌粉的生產(chǎn)制備過程中，菌液冷凍后需要進(jìn)行干燥，菌液中所添加的保護(hù)劑干物質(zhì)含量越高，干燥后所得菌粉中納豆菌的含量就相對(duì)越低.以脫脂乳粉作為保護(hù)劑，其最佳添加量在15%左右，干燥后的菌粉中干物質(zhì)含量較高，這樣就大大降低了納豆菌凍干菌粉中活菌含量，從而大大降低了納豆菌凍干制劑的生產(chǎn)效率.

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