傅靜娟 羅會(huì)盛 卞 勇 朱子寒 歐 寧

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)；3 江蘇省人民醫(yī)院，南京，210029)

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乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生作用機(jī)制研究

傅靜娟1羅會(huì)盛1卞 勇2朱子寒3歐 寧3

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)；3 江蘇省人民醫(yī)院，南京，210029)

目的：研究乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)與增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)表達(dá)的影響。方法：56只雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、賦形劑對(duì)照組、乳增寧組、乳安凝膠膏4.16 g/kg、2.08 g/kg、1.04 g/kg劑量組，共7組，采用注射苯甲酸雌二醇、黃體酮造模，給藥30 d。免疫組化法測(cè)定各組大鼠乳腺組織PCNA和VEGF的表達(dá)。結(jié)果：乳安凝膠膏劑4.16 g/kg、2.08 g/kg組能降低大鼠乳腺PCNA和VEGF的表達(dá)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，0.01)。結(jié)論：乳安凝膠膏劑可通過(guò)抑制其乳腺血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)活性，達(dá)到對(duì)抗大鼠乳腺增生的目的。

乳安凝膠膏劑；乳腺增生；PCNA；VEGF

乳安凝膠膏劑是由臨床上使用多年、療效確切的江蘇省中醫(yī)院驗(yàn)方改制而成，主要用于乳腺增生病的治療。本文主要通過(guò)觀察乳安凝膠膏劑對(duì)乳腺增生大鼠乳腺組織中的PCNA與VEGF表達(dá)的影響，探討其治療乳腺增生病的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 56只SD大鼠，雌性，健康未孕，體重(220±20)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 受試藥物 乳安凝膠膏由南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部制備，藥物組成：淫羊藿、延胡索、丁香、肉桂；藥物制備：淫羊藿水提，延胡索醇提，丁香肉桂提取揮發(fā)油，將上述提取物與氮酮加入空白凝膠膏料中攪勻，用層壓法將膏藥與保護(hù)層(聚乙烯薄膜)復(fù)合成制成乳安凝膠膏，晾干備用。

1.3 試劑 苯甲酸雌二醇，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：H20150510；黃體酮，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：H201505632；抗體，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液：自行配制，每升中含8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH調(diào)至7.4。

1.4 儀器 Leica ASP300S全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)；Shandon包埋機(jī)；Shandon手動(dòng)切片機(jī)；Shandon全自動(dòng)染色機(jī)；OLYMPUS顯微鏡。

2 方法[2-7]

2.1 分組及模型建立 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、賦形劑對(duì)照組、乳腺增生模型組、乳增寧組、乳安凝膠膏劑大劑量組、中劑量組、小劑量組。正常組不給予任何藥物，肌內(nèi)注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)25 d。其余各組大鼠肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)20 d，繼而改用黃體酮5 mg/kg，1次/d，連續(xù)5 d。

2.2 給藥 造模成功后，乳安凝膠膏劑大、中、小劑量組及賦形劑組每天進(jìn)行乳安凝膠膏劑外貼，選取造模后大鼠最腫大的第三對(duì)乳房用藥物外貼(大劑量組給予4.16 g/kg、中劑量組2.08 g/kg、小劑量組1.04 g/kg，每24 h換藥1次，連續(xù)30 d。乳增寧組每日上午空腹按劑量定時(shí)灌胃給藥一次(給予乳增寧，0.9 g/kg，連續(xù)30 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取大鼠第三對(duì)乳頭，稱重后，用10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水浸蠟后，進(jìn)行石蠟包埋、切片。步驟：1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；2)PBS洗二遍，每遍5 min；3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗1次；4)抗原修復(fù)；5)PBS洗5 min；6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min；7)甩去多余液體滴加一抗4 ℃過(guò)夜(過(guò)夜后在37 ℃復(fù)溫45 min)；8)PBS洗2次各5 min；9)滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；10)PBS洗2次各5 min;11)滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min；12)PBS洗2次各5 min；13)DAB顯色3～10 min在顯微鏡下掌握染色程度；14)蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染；15)脫水，透明，封片，鏡檢。每張切片取5個(gè)高倍視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測(cè)定各組光密度值。

3 結(jié)果

3.1 乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生組織VEGF表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。模型組大鼠乳腺組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，乳增寧組大鼠乳腺組織VEGF表達(dá)減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳安凝膠膏劑大劑量組大鼠乳腺組織中VEGF表達(dá)明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.2 乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生組織PCNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。模型組大鼠乳腺組織中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，乳增寧組乳腺組織中PCNA陽(yáng)性表達(dá)減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳安凝膠膏劑大、中劑量組乳腺組織中PCNA陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，0.05)。

表1 乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生組織VEGF表達(dá)的影響

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

表2 乳安凝膠膏劑對(duì)大鼠乳腺增生組織PCNA表達(dá)的影響

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

圖1 正常對(duì)照組VEGF表達(dá) 圖2模型對(duì)照組VEGF表達(dá)

圖3 賦形劑對(duì)照組VEGF表達(dá) 圖4乳增寧組VEGF表達(dá)

圖5 乳安凝膠膏劑大劑量組VEGF表達(dá) 圖6 乳安凝膠膏劑中劑量組VEGF表達(dá)

圖7 乳安凝膠膏劑小劑量組VEGF表達(dá) 圖8 正常對(duì)照組PCNA表達(dá)

圖9 模型對(duì)照組PCNA表達(dá) 圖10 賦形劑對(duì)照組PCNA表達(dá)

圖11 乳增寧組PCNA表達(dá) 圖12 乳安凝膠膏劑大劑量組PCNA表達(dá)

圖13 乳安凝膠膏劑中劑量組PCNA表達(dá) 圖14 乳安凝膠膏劑小劑量組PCNA表達(dá)

4 討論

VEGF最初是Senger等在腫瘤細(xì)胞分泌物中發(fā)現(xiàn)的，具有高度的血管滲透性，是重要的血管滲透性因子，它可增加毛細(xì)血管和小靜脈等微小血管對(duì)大分子的通透性，微血管通透性的增加可引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲，外漏的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白而沉積，并通過(guò)誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生而促進(jìn)體內(nèi)新生血管生成[8-10]。近年來(lái)，較多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血管生成與乳腺增生病的發(fā)生密切相關(guān)。宋愛(ài)莉[11]等對(duì)140例乳腺增生病患者進(jìn)行乳房腫塊活檢，觀察病變組織的病理分型類型、分級(jí)及VEGF、bFGF的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果顯示，不同病理分級(jí)的VEGF，bFGF表達(dá)存在差異，從一般增生到非典型增生，VEGF、bFGF的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。表明隨乳腺增生程度的增加，組織血管生成因子的表達(dá)增強(qiáng)，兩者存在相關(guān)性。段彥蒼[12]等通過(guò)制作乳腺增生的大鼠模型，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清VEGF和bFGF含量及其在乳腺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組大鼠血清中VEGF和bFGF含量明顯升高，在乳腺組織中表達(dá)增強(qiáng)。表明模型組大鼠體內(nèi)存在的某些血管因子被激活后，直接或間接促進(jìn)了局部乳腺組織血管的增生。

PCNA由Miyachi等于1978年首次發(fā)現(xiàn)并命名，一種分子量為36KD的酸性蛋白質(zhì)，以后的研究發(fā)現(xiàn)PCNA與表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，故又稱為周期蛋白，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用[13]，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。PCNA的表達(dá)程度和含量是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的客觀指標(biāo)，已證實(shí)PCNA的合成和表達(dá)與細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)[14]。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA陽(yáng)性表達(dá)增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，可見(jiàn)在造模的過(guò)程中，隨著乳腺組織VEGF、PCNA表達(dá)增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖增多，乳腺導(dǎo)管上皮的增殖活性加強(qiáng)，同時(shí)血管滲透性增加，引起血管中的蛋白質(zhì)外滲，乳腺組織發(fā)生一系列病理性變化。乳增寧組大鼠乳腺組織VEGF、PCNA表達(dá)減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乳安凝膠膏劑大劑量組大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA表達(dá)明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明外敷乳安凝膠膏劑后，乳腺增生大鼠乳腺組織中VEGF、PCNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示乳安凝膠膏劑可以通過(guò)降低VEGF的活性，抑制乳腺上皮細(xì)胞的增值，對(duì)乳腺增生起到一定的抑制作用。

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(2015-07-23收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Mechanism of Ru'an Ningjiao Ointment on Hyperplasia of Mammary Gland Rats

Fu Jingjuan1, Luo Shenghui1, Bian Yong2, Zhu Zihan3, Ou Ning3

(1AffiliatedHosptitaltoNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 3RenminHospitalofJiangsu,Nanjing210029,China)

Objective:To observe the mechanism of Ru'an Ningjiao ointmentm on tissue of rat vascular endothelial growth factor (PCNA) and the influence of PCNA (VEGF) expression in rats with hyperplasia of mammary gland.Methods:A total of 56 female unpregnant rats were randomly divided into 7 groups: normal control group, model group, excipient control group, Ruzengning group, Ru'an Ningjiao ointment 4.16 g/kg, 2.08 g/kg, 1.04 g/kg dose groups. Models were produced by injecting estradiol benzoate and progesterone for 30 days. Use immunohistochemical method to determine the expression of PCNA and VEGF in rats with breast hyperplasia.Results:Ru'an Ningjiao ointment 4.16 g/kg, 2.08 g/kg group can reduce the expression of PCNA and VEGF, and compared with model group, the difference had statistical significance(P<0.05, 0.01).Conclusion:Ru'an Ningjiao ointment can inhibit the mammary gland vascular endothelial growth factor and the expression of cell activity, and thus to control hyperplasia of mammary gland.

Ru'an Ningjiao ointment; Hyperplasia of mammary glands; PCNA; VEGF

江蘇省中醫(yī)藥管理局研究項(xiàng)目(編號(hào)：LZ09044)

傅靜娟(1982—)，女，南京人，碩士，主管中藥師，研究方向：藥劑學(xué)與臨床藥學(xué)、藥理學(xué)，E-mail：xiaoyi82231@sina.com

羅會(huì)盛，副主任中藥師，E-mail：luohuisheng9@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.026