車(chē)蘇容 陳金佩 鄭文偉 王阿四

(1 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州，350122；2 福建承創(chuàng)堂中藥有限公司，福州，350008)

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槲寄生飲片斷面異常綠色的成因分析及與質(zhì)量相關(guān)性的探究

車(chē)蘇容1陳金佩2鄭文偉1王阿四1

(1 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州，350122；2 福建承創(chuàng)堂中藥有限公司，福州，350008)

目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法分析槲寄生斷面異常綠色的成因并探討該綠色與質(zhì)量的相關(guān)性。方法：用溶劑提取該綠色成分，采用紫外燈下觀察熒光，紫外-可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)掃描、薄層色譜等方法判斷性質(zhì)，并用高效液相色譜法測(cè)有效成分紫丁香苷的含量。結(jié)果：該綠色成分可被95%或無(wú)水乙醇冷提，提取液在365 nm紫外光下顯紅色熒光，在波長(zhǎng)665 nm有最大吸收峰。該提取液薄層下相應(yīng)斑點(diǎn)Rf值及顏色與葉綠素相符合，紫丁香苷含量測(cè)定達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論：槲寄生的斷面綠色是由于葉綠素大量保留形成的。飲片的紫丁香苷含量不因綠色多少而減少。葉綠素被完好保存并顏色特異可能與加工方法、栽培條件、采收時(shí)間和貯藏條件等因素相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探討，但藥典的有關(guān)描述是否需要修訂值得商榷。

槲寄生；斷面;異常綠色；葉綠素；紫丁香苷

槲寄生為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝[1]。2010版藥典規(guī)定：“槲寄生表面黃綠色，金黃色或黃棕色，皮部黃色，木部色較淺”[1]；2015版藥典對(duì)這一描述未做任何修訂。而近幾年來(lái)我們?cè)谏唐凤嬈薪?jīng)常發(fā)現(xiàn)槲寄生飲片的斷面皮部為綠色；甚至皮部和髓部都為綠色，木部也微帶綠色，即藥材橫斷面整體為綠色,并且綠色異常偏藍(lán)，這與常見(jiàn)的葉綠素的綠色有一定偏差。該飲片斷面為綠色不符合藥典的描述，是否屬于正?，F(xiàn)象？市場(chǎng)人士的解釋為“新貨多為綠色，放置時(shí)間久了則綠色消失”。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)為葉綠素被完好保留的可能性最大。是需要修訂標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)描述，還是應(yīng)當(dāng)用陳貨？取決于該綠色成分是什么及該顏色與質(zhì)量?jī)?yōu)劣是否有相關(guān)性。為了證明猜想，我們擬通過(guò)溶劑來(lái)提取該飲片中的綠色成分。考慮到葉綠素較易溶于有機(jī)溶劑[2]，使用乙醇、石油醚可獲得槲寄生的主要葉綠素成分。葉綠素有特定的紫外-可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)[7]和熒光現(xiàn)象[8]，并可以通過(guò)與葉綠素的薄層層析對(duì)比[2-3]，證實(shí)葉綠素的存在。

1 儀器與試藥

L5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海安亭電子儀器廠)；安捷倫1260高效液相色譜儀(安捷倫科技北京有限公司)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；硅膠G板(100 mm×200 mm，青島海洋化工工廠分廠)。

槲寄生a(斷面黃色)、槲寄生b(斷面綠色)，槲寄生c(斷面黃綠混合)，均為市售飲片，經(jīng)鑒別為桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝。紫丁香苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111574-200201，供含量測(cè)定用)。新鮮菠菜(自購(gòu)于市場(chǎng))。甲醇為色譜純，無(wú)水乙醇、95%乙醇、磷酸、石油醚、乙酸乙酯、碳酸鈣均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 斷面綠色飲片提取液的強(qiáng)光照射和熒光觀察

2.1.1 槲寄生提取液的制備 將槲寄生b的飲片取適量粉碎，稱(chēng)取3.0 g；量取15 mL無(wú)水乙醇，超聲5 min。過(guò)濾，收集到試管中，備用。

2.1.2 強(qiáng)光照射實(shí)驗(yàn) 將提取液均分成兩份編號(hào)1、2。1號(hào)提取液放在日光燈管近距離強(qiáng)光下照射，2號(hào)放在暗處保存，經(jīng)過(guò)3～4 h后在白背景下觀察兩者的顏色差異。

2.1.3 熒光觀察 將1號(hào)提取液放在365 nm紫外燈下照射，觀察是否有熒光。

2.2 斷面綠色飲片的光照試驗(yàn) 取一定量的槲寄生b分成兩份編號(hào)1、2。1號(hào)放置在陽(yáng)光下光照，2號(hào)放置在無(wú)陽(yáng)光照射的地方，各放置一段時(shí)間后觀察對(duì)比兩者顏色變化。

2.3 兩種飲片提取液的紫外-可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)掃描

2.3.1 槲寄生提取液的制備 將槲寄生a、槲寄生b飲片取適量粉碎，分別稱(chēng)取2份1.0 g的粉末，編號(hào)1、2、3、4。將粉末分別倒入已編號(hào)的燒杯中，加入10 mL的95%乙醇，超聲處理5 min。取濾紙1張，置漏斗中，用95%乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到已編號(hào)的試管中。

2.3.2 波長(zhǎng)掃描 將提取液分別放入比色皿中，在波長(zhǎng)200～780 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2.3.3 紫外光照射 在陰暗條件下，將已編號(hào)的試管中的提取液放置于波長(zhǎng)為365 nm的紫外光下，觀察提取液是否有紅色熒光。

2.4 針對(duì)葉綠素相關(guān)成分的薄層層析對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.4.1 葉綠素對(duì)照品的制備 取新鮮菠菜剪去大葉脈，稱(chēng)取5.0 g，剪成小于2 mm寬的細(xì)絲。將材料加入已編號(hào)的250 mL的錐形瓶，各加入0.1 g的碳酸鈣、石油醚和無(wú)水乙醇混合液(3∶2)15 mL，然后在室溫條件下超聲處理20 min；取濾紙放入漏斗，用石油醚和無(wú)水乙醇混合液(3∶2)濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到已編號(hào)的試管中，備用。

2.4.2 槲寄生提取液的制備 分別稱(chēng)取槲寄生a和槲寄生b的粉末各5.0 g。同上方法制備，獲得槲寄生提取液作為樣品，備用。

展開(kāi)：在層析缸中加入20 mL石油醚和乙酸乙酯的混合液(3∶2)[2-3]，作為展開(kāi)劑，蓋好玻璃蓋，搖動(dòng)使層析缸中的蒸氣達(dá)到飽和。展開(kāi)，計(jì)算Rf值。

2.5 三種飲片中紫丁香苷的含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)參照2010版藥典規(guī)定的方法[1]，采用高效液相色譜法。

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液(15∶85)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取紫丁香苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取槲寄生a、b、c細(xì)粉各約2 g,精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min,放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

3 結(jié)果

3.1 斷面綠色飲片提取液的強(qiáng)光照射和熒光觀察 見(jiàn)圖1、圖2。

3.2 斷面綠色飲片的光照試驗(yàn) 見(jiàn)圖3。

3.3 兩種飲片提取液的紫外-可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)掃描 見(jiàn)圖4。

圖1 斷面綠色飲片提取液光照前后比較

注：1.光照前 2.光照后

圖2 斷面綠色飲片提取液熒光觀察

圖3 飲片光照前后照片

注：左：光照前 右：光照后

圖4 95%乙醇提取液吸收光譜掃描圖

注：實(shí)線(xiàn)為槲寄生a(斷面黃色) 虛線(xiàn)為槲寄生b(斷面綠色)

圖5 槲寄生飲片針對(duì)葉綠素相關(guān)成分的薄層展開(kāi)圖

注：Ⅰ、Ⅱ?yàn)殚渭纳鷄提取液，Ⅲ、Ⅳ為菠菜提取液，Ⅴ、Ⅵ為槲寄生b提取液 A.脫鎂葉綠素(Rf=0.82)B.葉綠素a(Rf=0.73)C.葉綠素b(Rf=0.64)D.葉黃素(Rf=0.47)

表1 兩種槲寄生飲片吸收峰對(duì)應(yīng)吸光度值

表1可以看出，槲寄生a(斷面黃色)和槲寄生b(斷面綠色)在波長(zhǎng)211 nm、216 nm、357 nm、665 nm處均有吸收峰。

3.4 針對(duì)葉綠素相關(guān)成分的薄層層析對(duì)比實(shí)驗(yàn) 見(jiàn)圖5。

3.5 三種飲片中紫丁香苷的含量測(cè)定 見(jiàn)圖6、表2。

圖6 HPLC色譜圖

注：A.對(duì)照品 B.供試品 1.紫丁香苷

表2 三種槲寄生飲片中的紫丁香苷的含量

注：2010版藥典規(guī)定，槲寄生飲片中紫丁香苷含量不少于0.025%。

4 討論

通過(guò)圖4和表1可以看出，槲寄生飲片的95%的乙醇提取液，經(jīng)過(guò)紫外-可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)掃描，在665 nm處均有吸收峰，但斷面綠色的槲寄生飲片(槲寄生b)樣品的吸光度遠(yuǎn)大于斷面黃色槲寄生飲片(槲寄生a)樣品的吸光度。根據(jù)文獻(xiàn)，葉綠素提取液在665 nm有最大吸收峰[7]，所以推斷槲寄生b斷面為綠色可能是葉綠素造成的結(jié)果。

圖1、圖2表明，斷面綠色飲片的無(wú)水乙醇提取液經(jīng)過(guò)強(qiáng)光照射綠色變淺消失。兩種槲寄生飲片的無(wú)水乙醇提取液放在紫外光365 nm和254 nm均顯紅色熒光，但365 nm下的紅色熒光更為明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)槲寄生b提取液的紅色熒光顏色比槲寄生a的提取液更深?？梢酝茢嚅渭纳鷅中含有葉綠素而且含量高于槲寄生a。根據(jù)文獻(xiàn)葉綠素提取液可以在紫外光線(xiàn)下顯紅色熒光[8]，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，嘗試過(guò)將槲寄生b提取液放置在陽(yáng)光下照射，發(fā)現(xiàn)隔了4 h后，槲寄生b的乙醇提取液顏色由深綠色變?yōu)辄S色。而后嘗試將槲寄生b的部分飲片放置在陽(yáng)光下晾曬(結(jié)果如圖1)，放置一段時(shí)間后與避光保存的同一批槲寄生b的飲片對(duì)比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)陽(yáng)光照射的槲寄生b的飲片顏色較避光保存的飲片淺，但比溶液狀態(tài)明顯顏色變化時(shí)間較長(zhǎng)。

為了進(jìn)一步確定，用薄層層析的方法來(lái)驗(yàn)證槲寄生b中是否含有葉綠素。參考李凱的方法[3]提取菠菜的葉綠素，作為葉綠素對(duì)照品。薄層展開(kāi)后(結(jié)果見(jiàn)圖4)發(fā)現(xiàn)在菠菜的葉綠素中含有的脫鎂葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的斑點(diǎn)與槲寄生的提取液展開(kāi)的斑點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)而且Rf值相同。證明了槲寄生a、b中確實(shí)含有葉綠素，且槲寄生b中葉綠素b的含量明顯高于槲寄生a。

如表2所示，一批斷面綠色飲片，一批斷面黃色飲片及一批混雜飲片按藥典規(guī)定測(cè)其有效成分紫丁香苷含量均達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)(不少于0.025%)，準(zhǔn)確地說(shuō)，斷面綠色或混雜綠色的飲片含量不比斷面黃色的飲片含量低，是否斷面綠色的含量更高，有待更多的批次樣品來(lái)證明。

根據(jù)文獻(xiàn)[6]提到有發(fā)現(xiàn)槲寄生斷面綠色的飲片，認(rèn)為可能類(lèi)似于黃芩受潮發(fā)綠的現(xiàn)象，并通過(guò)挑選金黃色斷面的槲寄生飲片25 ℃的室溫下浸泡72 h,撈出放置24 h，結(jié)果未出現(xiàn)發(fā)綠的現(xiàn)象，所以排除受潮引起發(fā)綠的推論，我們進(jìn)行了復(fù)驗(yàn)，結(jié)果是一致的。

考慮到槲寄生的市場(chǎng)價(jià)格低廉且槲寄生傳統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)中，不存在斷面綠色為佳的說(shuō)法，因此沒(méi)有必要進(jìn)行染色處理，這種行為的動(dòng)機(jī)顯然不成立。

5 結(jié)論與展望

斷面為綠色的槲寄生飲片中的綠色是由于含有葉綠素大量保留形成的。而葉綠素為一種天然色素，安全無(wú)毒[6]；不影響槲寄生的質(zhì)量。以藥典規(guī)定的紫丁香苷作為指標(biāo)成分考察飲片斷面綠色與質(zhì)量的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致辭含量變低的證據(jù)。

為何此種飲片的綠色保存完好，是采收過(guò)早葉綠素含量過(guò)高還是加工方法變了？(經(jīng)調(diào)查產(chǎn)地仍然以陽(yáng)光下晾曬為主)還是生長(zhǎng)過(guò)程中受到土壤、水質(zhì)或環(huán)境的影響？(葉綠素的生成與某些金屬元素相關(guān))為什么有的飲片是黃綠色有的是偏藍(lán)綠色，這種藍(lán)綠色是否正常？可否受到加工輔料或增重物質(zhì)的影響？筆者在此拋磚引玉，希望同行有更多思路，為提高槲寄生質(zhì)量作出研究貢獻(xiàn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版第一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:350.

[2]李芬芳,郭軍峰.菠菜中色素提取方法的改進(jìn)[J].渭南師范學(xué)院學(xué)報(bào)：綜合版,2011,26(10)：80-82,92.

[3]李凱.薄層色譜方法的改進(jìn)[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2008(1):163-166.

[4]張秀君,孫錢(qián)錢(qián),喬雙，等.菠菜葉綠素提取方法的比較研究[J].作物雜志,2011(3)：57-59.

[5]黃持都,胡小松,廖小軍，等.葉綠素研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2007(3)：114-118.

[6]黃劍林,周秦,馬潤(rùn)梅.薄層法對(duì)比兩種顏色槲寄生的成分[J].陜西中醫(yī),2006,27(10):1286.

[7]孔祥生,易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008:77-78.

[8]徐惠,朱鵬飛.“探秘生活中常見(jiàn)熒光物質(zhì)與熒光現(xiàn)象”活動(dòng)案例[J].化學(xué)教學(xué),2014,36(2)：31-33,36.

[9]陳小全,田坤新,邵輝瑩,等.菠菜葉綠素的提取及葉綠素銅鈉鹽的制備[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(4):259-261.

[10]賈淑梅，王君玲.菠菜中色素的提取及其性質(zhì)的研究[J].喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào),2002,23(3):51-53.

(2015-11-03收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Investigation on the Reason and Quality of Decoction Pieces of Colored Mistletoe Herb with Green Cross Section

Che Surong1, Chen Jinpei2, Zheng Wenwei1, Wang Asi1

(1FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122，China; 2FujianChengchuangtangTraditionalChineseMedicineCo.Ltd.,Fuzhou350008，China)

Objective:To investigate the reasons why the cross section of colored mistletoe herb can be green.Methods:The green components were extracted by solvent, and the property of the components were determined by ultraviolet light, fluorescent light-visible lights' wavelength scanning and thin layer chromatography, and the content of active components was determined by HPLC.Results:The 95% ethanol extract of green colored mistletoe herb pieces contained the green components. The ethanol extract had red fluorescence under 365 nm UV light and the wavelength of the maximum absorption peak was 665 nm. The Rf value and color of spot on extract correspond with chlorophyll. The syringin in the green decoction pieces of colored mistletoe herb reached Chinese Pharmacopoeia standards.Conclusion:The green color in the cross-section of colored mistletoe herb was caused by chlorophyll, and there was no declination of syringin. There should be more studies on the reasons why the chlorophyll was saved so well with the special green color. Whether the related description on China's pharmacopoeia should be revised should be further discussed.

Colored mistletoe herb; Cross section; Special green color; Chlorophyll; Syringin

福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201410393064)；福建中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科平臺(tái)資助項(xiàng)目(編號(hào)：X2014105)

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.031