郝燕勤

(赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

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HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定澤瀉藥材中3種有效成分含量的研究

郝燕勤

(赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

目的：建立澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種三萜化合物的含量測(cè)定方法，比較澤瀉藥材不同產(chǎn)地及不同炮制方式中3種三萜化合物的含量。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)，色譜柱：Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：室溫；流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈-水(70∶30)；流速：1.0mL/min，ELSD氣體流速：2.5L/min；漂移管溫度：90℃。結(jié)果：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的線性范圍分別為4.0～62μg(r=0.999 8)、4.8～68μg(r=0.999 7)、4.4～70μg(r=0.999 5)，平均回收率分別為97.75%、98.66%、99.13%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便靈敏，快速準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于澤瀉藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

澤瀉；23-乙酰澤瀉醇B；24-乙酰澤瀉醇A；澤瀉醇A；HPLC-ELSD法

澤瀉(AlismaOrientalis(Sam) Juzep.)為澤瀉科澤瀉屬多年生水生植物，干燥塊莖入藥，性寒，味苷、淡。澤瀉為我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥，據(jù)《中國(guó)藥典》(2010版)[1]記載，澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂之功效，可用于治療小便不利、水腫脹滿、高脂血癥等疾病。澤瀉以萜類(lèi)成分[2]為主，還含有多糖、少數(shù)黃酮、木脂素、植物甾醇等成分報(bào)道。其中，萜類(lèi)主要以原萜烷型四環(huán)三萜和愈創(chuàng)木烷型倍半萜類(lèi)化合物為主。研究表明，23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A為主要活性成分[3]，同時(shí)也是質(zhì)量控制指標(biāo)；24-乙酰澤瀉醇A由于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間溶解在質(zhì)子溶劑中最終轉(zhuǎn)化為澤瀉醇A。本研究選取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A 三種三萜化合物進(jìn)行含量測(cè)定[4]，由于三種化合物的紫外光譜圖為末端吸收，應(yīng)采用HPLC-ELSD法[5]在同一色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與試藥

1.1 材料

儀器：FCV-10AL vp色譜儀(日本島津)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Alltech ELSD-2000ES)； 十萬(wàn)分之一電子分析天平(美國(guó)Denvor公司)；KQ3200 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。對(duì)照品：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制。通過(guò)波譜方法(1H NMR 和13C NMR)鑒定，且純度達(dá)98%以上。

藥材：不同產(chǎn)地及炮制方式的澤瀉藥材，購(gòu)于四川、福建及廣州市清平藥材市場(chǎng)、安徽亳州藥材市場(chǎng)， 均由我校中藥學(xué)院鑒定。

1.2 試藥

試劑：甲酸、甲醇和乙腈為色譜純(Merck)；液相用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相為1%甲酸乙腈-水(70:30)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；ELSD參數(shù)：漂移管溫度90℃，霧化氣體流速2.5L/min。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對(duì)照品適量，加甲醇分別制成濃度為0.514 4、0.532 4、0.490 4mg/mL的儲(chǔ)備用溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取澤瀉藥材干燥塊莖適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱(chēng)取500mg，精密加入80%的甲醇25mL，稱(chēng)重，超聲提取30min，冷卻，稱(chēng)重補(bǔ)重，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取不同體積23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋?zhuān)苽湟幌盗胁煌瑵舛鹊膶?duì)照品混合溶液，分別精密吸取該梯度溶液20μL進(jìn)樣，以峰面積的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明3種成分線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的對(duì)照品混合溶液(濃度分別為51.4、53.2、49.0μg/mL)，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的RSD分別為0.82%、1.3%、1.4%，表明儀器精密度良好。

表1 3種指標(biāo)成分線性關(guān)系結(jié)果 (n=6)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批澤瀉藥材(編號(hào)ZX1)粉末，按“2.3”項(xiàng)方法制得6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的平均含量分別為0.08%、0.03%、0.01%，RSD分別為1.2%、1.9%、2.2%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12h測(cè)定，每次進(jìn)樣20μL。測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三個(gè)化合物的峰面積，計(jì)算RSD值分別為0.22%、0.28%、0.47%。表明三種化合物的供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的澤瀉藥材粉末(編號(hào)ZX1)，精密稱(chēng)取0.5g，共9份，每3份為一組，分別準(zhǔn)確加入“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5mL，按“2.3”項(xiàng)方法操作，依法測(cè)定。通過(guò)計(jì)算，23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種化合物的平均回收率分別為97.75%、98.66%、99.13%，RSD值分別為0.7%、1.4%、1.9%。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取市售不同產(chǎn)地及不同炮制方法的澤瀉藥材粉末，每個(gè)編號(hào)平行2份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)器選擇

澤瀉中大多數(shù)三萜成分的最大紫外吸收波長(zhǎng)為末端吸收，特征性不強(qiáng)，且受流動(dòng)相影響會(huì)產(chǎn)生基線漂移現(xiàn)象。本研究中3種四環(huán)三萜化合物結(jié)構(gòu)中僅有一個(gè)雙鍵、一個(gè)羰基，且不形成共軛，實(shí)驗(yàn)比較的UV 210nm和ELSD檢測(cè)結(jié)果同樣證明，ELSD的基線噪音明顯小于210nm。因此，選擇ELSD檢測(cè)更合理。

3.2 流動(dòng)相選擇

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果比較可得，乙腈較甲醇的分離度好，更適合漂移管的較高溫度；同時(shí)，酸性環(huán)境會(huì)使?jié)蔀a醇在HPLC分析中保持良好的峰形，有利于澤瀉藥材分析。因此，流動(dòng)相選擇0.1%甲酸乙腈-水系統(tǒng)。

表2 不同來(lái)源及不同炮制方式澤瀉藥材中3種有效三萜成分含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道，澤瀉中的三萜類(lèi)成分具有明顯的降血脂活性，《中國(guó)藥典》(2010版)澤瀉藥材項(xiàng)下只以單一成分23-乙酰澤瀉醇B作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種有效成分的高效液相色譜法，且選擇ELSD作為檢測(cè)器，方法靈敏度高，簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，為深入研究澤瀉藥材的質(zhì)量控制提供一定科學(xué)依據(jù)。

比較不同產(chǎn)地及炮制方法提取澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地及不同炮制提取方法澤瀉藥材中三種成分略有差別，原因可能與采集時(shí)間、海拔高度有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，澤瀉因春、秋季節(jié)采集、炮制提取方法不同，其利尿作用強(qiáng)度亦不同。因此，今后對(duì)澤瀉的化學(xué)成分、質(zhì)量控制、活性評(píng)價(jià)方面，應(yīng)考慮采收季節(jié)、炮制方式等影響因素。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M]. 南京：南京大學(xué)出版社，2010.

[2] 朱玉嵐，彭國(guó)平. 澤瀉的萜類(lèi)化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2006(18)：348-351.

[3] 彭賢,黃舒,酈皆秀,等.澤瀉屬植物化學(xué)成分與藥理活性[J].國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè), 2000, 15(6)：245-247.

[4] 周壇樹(shù), 施大文. 不同產(chǎn)地澤瀉中主要成分的HPLC測(cè)定[J]. 中藥材, 2000, 23(11)：687-688.

[5] 黃永焯, 王寧生. HPLC-ELSD在天然藥物分析中的應(yīng)用[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2001, 12(6)：444-448.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2015-06-23

郝燕勤(1969-)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院中級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樗帉W(xué)分析。

R284.2

A

1673-2197(2015)22-0032-02

10.11954/ytctyy.201522013