孔桂菊，杜鴻志，袁勝濤，孫 立

(中國(guó)藥科大學(xué) 江蘇省新藥篩選中心，江蘇 南京 210009)

?

金花茶正丁醇提取物對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌作用研究

孔桂菊，杜鴻志，袁勝濤*，孫 立*

(中國(guó)藥科大學(xué) 江蘇省新藥篩選中心，江蘇 南京 210009)

目的：研究金花茶正丁醇提取物對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌模型腫瘤發(fā)生的作用。方法：以烏拉坦(800mg/kg)每周2次，連續(xù)5周腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，金花茶正丁醇提取物連續(xù)灌胃14周。檢測(cè)肺癌發(fā)生率，小鼠血清和肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)與腫瘤壞死因子(TNF-α)變化。結(jié)果：金花茶正丁醇提取物使烏拉坦誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生率降為75.0%，模型組為90.5%；正丁醇組與模型組相比，血清中SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量上升，組織中SOD、CAT含量顯著升高，血清與組織中MDA下降無(wú)顯著性差異。結(jié)論：金花茶正丁醇提取物對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌有預(yù)防作用，主要機(jī)制可能與其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

金花茶；烏拉坦；肺癌

金花茶是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)珍稀保護(hù)植物，被譽(yù)為“植物界的大熊貓”，現(xiàn)在已經(jīng)有很多人關(guān)注與研究金花茶的栽培育種，以使其發(fā)揮更好的觀賞價(jià)值與其他應(yīng)用價(jià)值。金花茶富含400多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)及藥用成分，目前對(duì)金花茶抗腫瘤的研究正在進(jìn)行中，很多報(bào)道表明[1-2]金花茶對(duì)體外前列腺癌、胃癌、鼻咽癌、食管鱗癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等細(xì)胞具有很好的生長(zhǎng)抑制作用，其作用機(jī)制大多報(bào)道為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。關(guān)于金花茶提取物對(duì)體內(nèi)腫瘤的抑制作用還未見(jiàn)報(bào)道，本文首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金花茶正丁醇提取物是否具有防癌效果，觀察金花茶正丁醇提取物對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌的作用，并進(jìn)一步探討金花茶正丁醇提取物防癌作用的機(jī)制，為金花茶“藥食兩用”的開發(fā)提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，雌性，體重18～22g，SPF級(jí)，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0140158。

1.2 藥品與試劑

金花茶正丁醇部位由南京理工大學(xué)賈愛(ài)群教授實(shí)驗(yàn)室提供；烏拉坦(Urethane，94300)購(gòu)于瑞士Sigrna-alrich公司；超氧化物歧化酶(superoxde dismutas，SOD)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)測(cè)定試劑盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-2(IL-2)及腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)于上海裕臣生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥品與試劑配制

烏拉坦臨用前用生理鹽水配制，濃度為80mg/mL。金花茶正丁醇提取部位藥物用0.5%的CMCNa配置成10mg/mL。

2.2 模型建立與分組給藥

KM小鼠隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組、模型組、金花茶正丁醇提取物組(簡(jiǎn)稱正丁醇組)分別有15、25、15只。模型組、正丁醇組小鼠腹腔注射烏拉坦800mg/kg，每周2次，連續(xù)5周，在造模的同時(shí)正丁醇組灌胃給予金花茶正丁醇提取物100mg/kg/d，連續(xù)14周，第15周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

生：我是假設(shè)左邊三角形的底是a，右邊三角形的底是b，那么陰影部分的面積就是a×8÷2+b×8÷2，我們知道可以利用乘法分配律a×8÷2+b×8÷2=（a+b）×8÷2，而a+b=12，所以三角形的面積是12×8÷2=48（平方厘米）。

2.3 取材和觀察指標(biāo)

收集血樣及心、肝、脾、肺、腎、胸腺等內(nèi)臟。準(zhǔn)確稱取肝臟、脾臟、肺與胸腺的重量，計(jì)算臟器系數(shù)。記錄肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。隨機(jī)選取每組4只小鼠的肺臟做HE染色。檢測(cè)血清與組織中SOD、CAT、MDA、IL-2及TNF-α。具體應(yīng)用方法參照試劑盒說(shuō)明書。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌小鼠體重的影響

對(duì)照組小鼠體重在第1、2、3周增長(zhǎng)較快，4～14周穩(wěn)步增長(zhǎng)。模型組、正丁醇組小鼠體重在造模并給予藥物的同時(shí)穩(wěn)步增長(zhǎng)，在6～14周也無(wú)明顯差異。僅在第2、3、4周正丁醇組體重與對(duì)照組具有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌小鼠體重的影響

3.2 金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌小鼠臟器系數(shù)的影響

各組臟器經(jīng)過(guò)稱重發(fā)現(xiàn)，模型組與對(duì)照組相比脾臟重量降低且具有顯著性差異，其他各組間均無(wú)顯著性差異。各組的脾臟臟器系數(shù)為：模型組<正丁醇<對(duì)照組。表1中可以發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組相比，肝臟增大，脾臟減小，胸腺增大，肺增大；正丁醇組與對(duì)照比胸腺基本無(wú)變化，脾臟稍有減小，肝臟略減小，肺基本無(wú)變化。

表1 金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌小鼠臟器系數(shù)的影響 (±s)

注：***P<0.001。

對(duì)照組正常肺呈淡粉色，表面光滑，無(wú)突出物。患肺癌小鼠肺部整體呈淡粉色，上面有很多白色圓形結(jié)節(jié)點(diǎn)，略突出于肺表面。在第9、10、14周時(shí)取部分模型組小鼠解剖，查看肺腫瘤形成情況，肺結(jié)節(jié)在第9周已經(jīng)可見(jiàn)，第14周時(shí)可見(jiàn)較大的肺結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組無(wú)小鼠發(fā)生肺腫瘤，模型組肺腫瘤發(fā)生率為90.5%，金花茶正丁醇提取物組肺腫瘤發(fā)生率為75.0%。金花茶正丁醇提取物組左右肺平均結(jié)節(jié)數(shù)均小于模型組。

3.4 金花茶對(duì)肺組織HE染色的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組選擇4只進(jìn)行HE染色，結(jié)果為對(duì)照組正常肺組織由肺泡及肺內(nèi)支氣管組成，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁輕度充血，無(wú)腫瘤細(xì)胞(見(jiàn)圖3對(duì)照組)。模型組4只小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)腫瘤或腫瘤性增生病灶(出現(xiàn)率100%)。模型組腫瘤細(xì)胞體積大，略呈柱狀或多邊形，細(xì)胞核大、深染、核仁大而明顯，核分裂現(xiàn)象易見(jiàn)，肺柱狀其它部位中度出血(見(jiàn)圖3模型組)，還有2只出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。正丁醇組中4只小鼠無(wú)腫瘤或腫瘤增生性病灶(出現(xiàn)率0%)，肺泡壁輕度充血、水腫(見(jiàn)圖3正丁醇組)，有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞類型主要為中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。

表2 金花茶正丁醇提取物對(duì)小鼠肺腫瘤發(fā)生的影響 (±s)

3.5 金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌小鼠的生化指標(biāo)影響

在血清檢測(cè)中，模型組小鼠相對(duì)于正常對(duì)照組CAT、SOD、IL-2、TNF-α降低，MDA升高，無(wú)顯著性差異。正丁醇組相對(duì)于模型組，使烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌血清CAT、SOD、IL-2、TNF-α的含量升高，MDA含量下降，但無(wú)顯著性差異。在肺組織檢測(cè)中，模型組小鼠相對(duì)于正常對(duì)照組CAT、SOD含量降低，MDA含量升高，無(wú)顯著性差異。正丁醇組相對(duì)于模型組，使烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌組織CAT、SOD含量顯著升高，使MDA含量降低但無(wú)顯著性差異。

圖2 烏拉坦致肺癌變化情況

圖3 金花茶正丁醇提取物對(duì)烏拉坦致肺癌小鼠肺組織HE染色結(jié)果(HE，×200)

4 討論

小鼠肺癌模型建立的方法較多，烏拉坦是一種較好的致肺部腫瘤藥物[3]，采用昆明小鼠是因?yàn)槠渲掳┍容^敏感[4]，采用多次腹腔注射可以提高致癌率[5]，本實(shí)驗(yàn)在給藥14周后已經(jīng)造模成功，模型組成瘤率為90.5%。小鼠體重在造模初期與對(duì)照組相比會(huì)有差異，但是整個(gè)造模過(guò)程體重變化與對(duì)照組基本一致，這與文獻(xiàn)報(bào)道烏拉坦不會(huì)影響小鼠體重相符[6]。我們誘導(dǎo)小鼠肺癌模型，研究金花茶正丁醇提取物對(duì)肺腫瘤發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)金花茶正丁醇提取物可以降低腫瘤發(fā)生率，使腫瘤數(shù)目減少，表明金花茶正丁醇提取物具有預(yù)防腫瘤發(fā)生及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。通過(guò)HE染色證明模型組肺腫瘤形成，金花茶正丁醇提取物具有預(yù)防肺腫瘤作用。金花茶正丁醇提取物對(duì)肺癌的抑制率不是很高，可能是該提取物很難逆轉(zhuǎn)烏拉坦致肺癌的效果。另外金花茶正丁醇提取物可能對(duì)不同癌癥模型效果不同，研究表明金花茶正丁醇提取物對(duì)腸癌抑制效果很好，今后我們會(huì)多考慮不同藥物誘癌并增多癌癥模型進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證金花茶的抗癌效果。

表3 金花茶正丁醇提取物對(duì)小鼠血清中MDA、SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量的影響 (±s)

表4 金花茶正丁醇提取物對(duì)小鼠肺癌組織中MDA、SOD、CAT含量的影響 (±s)

注：*P<0.05 vs 模型組，***P<0.001 vs 模型組。

SOD、CAT屬于體內(nèi)消除自由基的酶類，它們與體內(nèi)其他抗氧化劑組成一個(gè)自由基的防御系統(tǒng)，以清除過(guò)多的自由基，防止自由基誘癌、促癌、致癌。MDA為反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞的損傷程度及受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。文獻(xiàn)報(bào)道[7-10]金花茶提取物具有很好的抗氧化與清除自由基能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金花茶正丁醇提取物使小鼠肺癌組織中SOD、CAT的含量顯著增加，使MDA含量降低，我們推測(cè)金花茶預(yù)防肺癌的效果與其抗氧化作用相關(guān)。

IL-2與反應(yīng)細(xì)胞的IL-2受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)TH、TC細(xì)胞增殖；激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，活化巨噬細(xì)胞；增強(qiáng)NK細(xì)胞和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生[11]。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬。在本研究中金花茶提取物升高小鼠血清中的IL-2與TNF-α含量，但是效果不明顯。脾臟為免疫器官，模型組中脾臟減小而給藥金花茶正丁醇提取物后與對(duì)照組無(wú)差異。金花茶提取物的防癌抗癌作用是否與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本文首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金花茶正丁醇提取物確實(shí)具有預(yù)防烏拉坦誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的作用，金花茶作為中藥預(yù)防腫瘤發(fā)生效果可觀，將其作為預(yù)防腫瘤的藥物開發(fā)具有深遠(yuǎn)影響，我們今后將對(duì)其分子作用機(jī)制及對(duì)其他腫瘤的抑制效果進(jìn)行深入研究，為開發(fā)藥物提供參考。

[1] 賀棟業(yè)，王麗麗，曹振輝，等.金花茶抗腫瘤功效研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015,11(3):68-71.

[2] JIA-NI LIN，HUI-YI LIN，NING-SUN YANG，et al.Chemical Constituents and Anticancer Activity of Yellow Camellias against MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells[J].Agric. Food Chem，2013(61): 9638-9644.

[3] KREISEL D，GELMAN AE，HIGASHIKUBO R，et al.Strain-specific Variation in murine natural killer gene complex contributes to differrences in immunosurveillance for urethane-induced lung cancer[J].Cancer Res，2012，72(17):4311-4317.

[4] 李怡嵐，何寧，喬姍姍，等．不同品系小鼠對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺腫瘤的敏感性[J]．中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2006，24(11):671．

[5] NARAYAN C，KUMAR A．Congstitutive over expression of IL-1β，IL-6，NF-κB，and Stat3 is a potential cause of lung tumorgenesis in urethane (ethyl carbamate) induced Balb/c mice[J]．J Carcinog，2012，11(9)：1-10．

[6] TERRYW. MOODYA， JULIUS LEYTONA， FARAH ZIAA， et al .Thymosina1 is chemopreventive for lung adenoma formation in A/J mice[J]. Cancer Letters， 2000，155(2): 121.

[7] CHUN-PENG WAN，YAN-YING YU，SHOU-RAN ZHOU，et al.Antioxidant and Free Radical Scavenging Activity of Camellia nitidissima Chi[J].Asian Journal of Chemistry，2011，23(7):2893-2897.

[8] LIXIA SONG，XIANGSHE WANG， XUEQIN ZHENG，et al.Polyphenolic antioxidant profiles of yellow camellia[J].Food Chemistry，2011(129): 351-357.

[9] 牛廣俊，朱思，陳清英，等.金花茶不同部位多糖的測(cè)定及體外抗氧化活性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(20)：168-172.

[10] 盧春毅 ，劉 紅， 楊 曦，等.金花茶對(duì)衰老大鼠的抗氧化和抗凋亡作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2015(35):172-173.

[11] 楊寶峰.藥理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：478.

(責(zé)任編輯：余 婷)

Study Effect of Extrative Fraction of Camellia chrysantha(Hu) Tuyama from n-butyl alcohol on Lung Carcinogenesis Induced by Urethane

Kong Guiju,Du Hongzhi，Yuan Shengtao*,Sun Li*

(Jiangsu Center for New Drug Screening,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective:To study the effect of extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol on lung carcinogenesis induced by urethane.Methods:The mouse lung carcinoma model was induced by intraperitioneal urethane 800 mg/kg twice a week for five weeks. The animals were treated with extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol for 14 weeks to investigate the rate of tumor incidence.The change of SOD,CAT,MDA,IL-2 and TNF-α in serum and in lung homogenate were tested.Results:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol could make urethane induced lung cancer incidence reduced to 75%,the model group was 90.5%;in N-butyl alcohol group compared with model group,the serum SOD,CAT,IL-2 and TNF-α levels rose,the content of SOD and CAT in lung homogenate increased significantly,the MDA in serum and tissue was down and there was no significant difference.Conclusion:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol can prevent lung carcinogenesis induced by urethane,which might be related to its antioxidantion and immune-regulation.

Camellia Chrysantha Tuyama;Urethane;Lung Cancer

2015-06-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃，2014AA022208)

孔桂菊(1990-)，女，中國(guó)藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。

通訊簡(jiǎn)介：袁勝濤(1967-)，男，博士，中國(guó)藥科大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)；孫立(1976-)，女，博士，中國(guó)藥科大學(xué)副教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)21-0004-03

10.11954/ytctyy.201521002