豐 飛,金偉東

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.南通大學(xué),江蘇 南通 226001)

?

銀杏葉提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊血管內(nèi)皮生長因子的影響

豐 飛1,金偉東2

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.南通大學(xué),江蘇 南通 226001)

目的：探討銀杏葉提取物對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法：將48只SD大鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組大鼠12只；另建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型36只，分為三組，每組12只:分為銀杏葉提取物組、辛伐他汀組、未干預(yù)組。干預(yù)4周后分別取胸主動(dòng)脈組織，進(jìn)行VEGF免疫組織化學(xué)檢查，再將所取主動(dòng)脈組織進(jìn)行VEGF的RT-PCR及Western-blot蛋白印跡分析。結(jié)果：正常對(duì)照組無VEGF表達(dá),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組VEGF表達(dá)明顯低于未干預(yù)組。銀杏葉提取物組和辛伐他汀組VEGF相對(duì)吸光度值顯著低于未干預(yù)組(P<0.05) 。結(jié)論：銀杏葉提取物可降低大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中VEGF表達(dá)，從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮、穩(wěn)定粥樣斑塊的作用。

血管內(nèi)皮生長因子；銀杏葉提取物；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與破裂所導(dǎo)致的急性心血管事件嚴(yán)重危害人類生命健康。據(jù)現(xiàn)有研究：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成機(jī)制具有重要意義[1]。他汀類藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化作用已得到廣泛認(rèn)同[2]，其機(jī)制之一與該類藥物能減少血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮，穩(wěn)定斑塊有關(guān)。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extracts，GBE)含有天然有效成分黃酮醇苷(flavonoids glycosidic)和萜類內(nèi)酯(ginkgolide)[3]，在抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞方面已有不少研究成果[4]。本實(shí)驗(yàn)使用銀杏葉提取物干預(yù)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，并與辛伐他汀干預(yù)進(jìn)行比較，探討銀杏葉提取物是否具有減少血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，減輕和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊的作用及其相應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 基本物品準(zhǔn)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康、成熟、8周齡雄性SD大鼠(rattus norvegicus)48只，體重為(200±20)g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要藥物、試劑及儀器 丙基硫氧嘧啶：南通精華制藥有限公司(50mg/片)。普通飼料、高脂飼料(含膽固醇、膽酸鈉、豬油、白糖等)：江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。維生素D3：30萬U/支，上海通用藥業(yè)股份有限公司。銀杏葉提取物：銀杏葉片(成藥)，每片含有效成分黃酮醇苷9.6mg,萜類內(nèi)酯2.4mg，江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司。辛伐他汀(舒降之,20mg/片)：默沙東(中國)制藥有限公司。大鼠VEGF單克隆抗體：南京建成生物工程研究所。一步法RNA 聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒:Takara公司。721 型分光光度計(jì):東方儀器廠。Smartscape生物顯微、電泳圖像處理系統(tǒng):奧林巴斯Olympus。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 48只雄性大鼠隨機(jī)分成四組，每組12只：①正常對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)；②銀杏葉片組(GBE組)：高脂喂養(yǎng)+銀杏葉片；③辛伐他汀組：高脂喂養(yǎng)+辛伐他汀；④未干預(yù)組：高脂喂養(yǎng)，不加其他干預(yù)。

1.2.2 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立 參照既往研究，建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型[5-6]：采用維生素D3[7]30萬U/kg體重腹腔注射加含3%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶+10%豬油+5%白糖和81.5%普通飼料的高脂飼料喂養(yǎng)，并于上述飼料喂養(yǎng)后第7天使用球囊損傷主動(dòng)脈內(nèi)皮。喂養(yǎng)8周，Doppler超聲驗(yàn)證主動(dòng)脈斑塊形成。

1.2.3 藥物干預(yù) 銀杏葉片組每日喂服銀杏葉片0.5片/(kg·d)(每片含黃酮醇苷9.6mg,萜類內(nèi)酯2.4mg)；辛伐他汀組每日喂服辛伐他汀5.0mg/(kg·d)；高脂飲食組,生理鹽水灌胃。所有動(dòng)物均自由飲水,最終取得完整資料者進(jìn)入分析,共45只,銀杏葉片組11只,辛伐他汀組11只,未干預(yù)組11只,正常對(duì)照組12只。

1.2.4 標(biāo)本收集與處理 所有大鼠用氯胺酮麻醉后，打開胸腔，剪取主動(dòng)脈弓至膈肌以上主動(dòng)脈1.5～2cm，將胸主動(dòng)脈標(biāo)本立即投入10%甲醛液固定，在病理人員協(xié)助下制作主動(dòng)脈切片，HE染色。同時(shí)取新鮮的血管組織標(biāo)本,利用大鼠VEGF單克隆抗體行VEGF免疫組織化學(xué)檢查,以PBS代替VEGF單克隆抗體作為陰性對(duì)照,請(qǐng)兩位病理學(xué)專業(yè)人員在事先未告知實(shí)驗(yàn)情況的前提下對(duì)各組免疫組織化學(xué)染色最顯著區(qū)域VEGF信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí):陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)步驟：組織總RNA一步法提取。

Western-Blot蛋白印跡分析：制作組織勻漿液，并加入蛋白裂解液,各樣本4℃高速離心20min,定量后各取等量樣本行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉液封閉1h。將膜與一抗共同孵育90min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共同孵育45min,加等體積增強(qiáng)發(fā)光化學(xué)試劑孵育1min。在暗室將膜在感光膠片上曝光并用相紙顯影洗像,調(diào)整曝光時(shí)間直至顯影出電泳帶,采用生物電泳圖像處理系統(tǒng)對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行分析。以β-actin 作為內(nèi)參照,以各組產(chǎn)物吸光度值與β-actin 吸光度值的比值作為各組產(chǎn)物相對(duì)吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果

蘇木精-伊紅染色(HE)結(jié)果：正常對(duì)照組(圖1)大鼠主動(dòng)脈光鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜光滑,未見脂紋,內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚;中膜主要由呈同心排列的彈性纖維膜組成，基質(zhì)內(nèi)可見有環(huán)形的平滑肌細(xì)胞;外膜較薄，為疏松結(jié)締組織，內(nèi)含少量平滑肌細(xì)胞。未干預(yù)組(圖2)內(nèi)膜增厚 ,透明變性,粥樣斑塊隆起,斑塊內(nèi)可見脂質(zhì)沉積和大量泡沫細(xì)胞,中膜彈力纖維和膠原纖維形態(tài)較紊亂。銀杏葉提取物組(圖3)、辛伐他汀組(圖4)均未見明顯粥樣斑塊，內(nèi)膜增生程度低于未干預(yù)組,中膜彈力纖維和膠原纖維形態(tài)優(yōu)于未干預(yù)組。

圖1 正常對(duì)照組(300×) 圖2 未干預(yù)組(300×)

圖3 銀杏葉提取物組(300×) 圖4 辛伐他汀組(300×)

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

正常對(duì)照組主動(dòng)脈則未見VEGF 陽性表達(dá)(圖5)。未干預(yù)組(圖6)粥樣斑塊區(qū)可見密集分布的染成棕色不規(guī)則斑點(diǎn)的VEGF陽性表達(dá)信號(hào),銀杏葉提取物組(圖7)、辛伐他汀組(圖8)粥樣斑塊不明顯，VEGF陽性表達(dá)信號(hào)的棕黃色斑點(diǎn)顯微鏡下觀察已不明顯。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組與未干預(yù)組比較，有顯著差異(P<0.001)，VEGF信號(hào)強(qiáng)度弱于未干預(yù)租；而銀杏葉提取物組與辛伐他汀組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖5 正常對(duì)照組(300×) 圖6 未干預(yù)組(300×)

2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

正常對(duì)照組無擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組可見擴(kuò)增產(chǎn)物模糊條帶,未干預(yù)組則呈現(xiàn)強(qiáng)亮度條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為380 bp (圖9) 。未干預(yù)組條帶亮度明顯高于銀杏葉提取物組、辛伐他汀組。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組吸光度值分別與未干預(yù)組比較，差異顯著(P<0.001),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組相對(duì)吸光度值相比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

圖7 銀杏葉提取物組(300×) 圖8 辛伐他汀組(300×)

組別強(qiáng)陽性弱陽性陰性合計(jì)GBE組?010111辛伐他汀組?07411未干預(yù)組110011正常對(duì)照組001212合計(jì)11171745

注：與未干預(yù)組比較，*P<0.001。

圖9 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析結(jié)果

2.4 Western-Blot蛋白印跡分析結(jié)果

正常對(duì)照組無VEGF表達(dá),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組及未干預(yù)組均可見不同密度VEGF表達(dá)(圖10) ：未干預(yù)組VEGF信號(hào)強(qiáng)度明顯高于銀杏葉提取物組和辛伐他汀組。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組吸光度值分別與未干預(yù)組比較，差異顯著(P<0.001),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組相對(duì)吸光度值比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

圖10 Westen Blot 蛋白印跡分析結(jié)果

表2 各組血管內(nèi)皮生長因子逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot產(chǎn)物相對(duì)吸光度值變化 (±s)

注：與未干預(yù)組比較，*P<0.001。

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子,在血管新生過程中具有重要意義,抑制VEGF 在動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)可一定程度地控制斑塊生長進(jìn)程[8]。

VEGF在血管發(fā)育、重構(gòu)和成熟過程中起重要的調(diào)控作用：VEGF可通過炎癥浸潤和新生血管形成等機(jī)制促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)展，與斑塊的不穩(wěn)定性有密切關(guān)系[9]。Chen等[10]研究證實(shí)，在粥樣斑塊平滑肌及巨噬細(xì)胞中，都有VEGF的強(qiáng)表達(dá)。VEGF陽性細(xì)胞數(shù)目與內(nèi)膜血管化程度正相關(guān)，且VEGF陽性細(xì)胞分布與新生血管分布高度一致，即主要位于斑塊肩部和纖維帽部。在血流剪切力的作用下，斑塊的上述部分易發(fā)生破裂，導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生。進(jìn)一步研究斑塊損傷區(qū)域VEGF，將為穩(wěn)定粥樣斑塊，預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生提供新的研究方向。

目前關(guān)于他汀類藥物對(duì)粥樣斑塊穩(wěn)定性影響的研究很多[11],銀杏葉提取物防治動(dòng)脈粥樣硬化中的機(jī)制也不再局限于抗氧化，調(diào)節(jié)血脂[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：銀杏葉提取物和辛伐他汀均能夠明顯降低VEGF 在大鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot 蛋白印跡分析從mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果?？梢娿y杏葉提取物和辛伐他汀可通過降低VEGF 在粥樣斑塊中的表達(dá)，在一定程度上抑制血管新生,這與他汀抑制血管新生的報(bào)道結(jié)果一致[13]。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了銀杏葉提取物對(duì)粥樣斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)的下調(diào)作用，而VEGF水平的下降能夠起到穩(wěn)定粥樣斑塊，防止斑塊破裂作用。近年來國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過多種作用機(jī)制抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[14]。銀杏葉提取物作為眾多治療動(dòng)脈粥樣硬化的天然藥物中療效較為突出的藥物，值得進(jìn)一步研究。

[1] 章燕幸，陳懷紅.血管內(nèi)皮生長因子與動(dòng)脈粥樣硬化[J].國際腦血管病雜志，2006，14(6)：452-455.

[2] 尚可，袁展群.辛伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制[D].南昌：南昌大學(xué)， 2008.

[3] 唐慧勤，王乃平，張玉萌.中藥抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2006，3(3)：14.

[4] 徐艷芬，張麗娟，宋新波.銀杏葉提取物研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33(6):452-456.

[5] 楊軍珂，郭延松，吳宗貴，等.一種大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的建立[J].中國心血管雜志，2004，9(5)：353-356.

[6] 郭延松，吳宗貴，楊軍珂，等. 三種大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型復(fù)制方法的比較[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2003，11(5)：465-469.

[7] 劉磊，焦向英，張煒芳，等.高脂飼料及維生素D3聯(lián)合應(yīng)用建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36(6)：681-684.

[8] ALAN NT, KEVIN GP, MICHAEL HS, et al.Neovascularization in atherectomy specimens from patients with unstable angina:Implications for pathogenesis of untable angina[J].American Heart Journal,1998, 135(1):10-14.

[9] 趙仙先，朱家麟，張寶仁，等.血管內(nèi)皮生長因子在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20(9):669-671.

[10] CHEN YX, NAKASHIMA Y, TANAKA K,et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary arteries[J].Arteoscler Thromb Vasc Bio,1999,19(1):131-139.

[11] 張敏,陳楨月,陸國平，等.辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-2304 細(xì)胞分化抗原40 誘導(dǎo)表達(dá)的影響[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2003,11(3):234-237.

[12] 牟冷麗，寇俊萍，朱丹妮，等.銀杏葉提取物的化學(xué)成分及其抗氧化活性[J].中國天然藥物，2008，6(1)：26-28.

[13] VINCENT L, SORIA C, MIRSHAHI F,et al. Cerivastatin, an inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase,inhibits endothelial cell proliferation induced by angiogenic factors in vitro and angiogenesis in in vivo models[J].Arteoscler Thromb and Vasc Bio,2002,22(4):623-629.

[14] 萬冬宇，黃維義.銀杏葉提取物抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2010,31(1)：131-133.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Effects of Ginkgo Biloba Extracts on VEGF of Atherosclerotic Aortic Plague of Rat

Feng Fei1，Jin Weidong2

(1.Jiangsu University Affiliated Hospital , Zhenjian 212001,China; 2.Nantong University, Nantong 226001, China)

Objective:The aim of this study is to demonstrate whether GBE has the effect that decrease VEGF in the plaque of atherosclerotic rat.Methods:Duplication of atherosclerotic rat , 36 atherosclerotic rats were randomly divided into 3 groups:12 intervened by GBE,12 intervened by simvastatin and 12 without drug intervention for another 4 weeks.Then the rats were executed to take specimens from aorta HE staining and immunohistochemistry assay to observe the expression of VEGF. At the same time ,specimens were taken into RT-PCR and Western-blot.Results:No VEGF was expressed in normol group. Non-intervention group had stronger density expressing VEGF than the drug intervention groups .The relative absorbency of GBE group and simvastatin group is lower than that of non intervention group(P<0.05).Conclusion:GBE can reduce the expression of VEGF so as to protect the blood vessel endothelium cell and stabilify the plaque.

Vascular Endothelial Growth Factor；Ginkgo Biloba Extracts；Atherosclerosis

2014-11-07

豐飛(1976-)，男，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榧毙孕难懿〉闹委煛?/p>

R285.5

A

1673-2197(2015)07-0005-03

10.11954/ytctyy.201507003