馬 琳，黃小方，歐陽(yáng)輝，黃檢平，葉鳳玉，葉喜德*

(1.撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；3.上高縣中醫(yī)院，江西 上高 336400)

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UHPLC/Q-TOF-MS/MS快速鑒定陳皮化學(xué)成分

馬 琳1，黃小方2，歐陽(yáng)輝2，黃檢平3，葉鳳玉2，葉喜德2*

(1.撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；
3.上高縣中醫(yī)院，江西 上高 336400)

目的：通過超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)陳皮化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。方法：采用 Welchrom C18色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫進(jìn)行色譜分離；質(zhì)譜采用電噴霧(ESI)離子源，在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，運(yùn)行時(shí)間40min，使用質(zhì)譜分析軟件Peakview中的目標(biāo)化合物篩查法，結(jié)合保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片鑒定監(jiān)測(cè)到的化學(xué)成分。結(jié)果：分離并鑒定出32個(gè)化學(xué)成分。結(jié)論：該方法快速、靈敏度高，可作為鑒定陳皮化學(xué)成分的一種有效方法。

陳皮；UPLC/Q-TOF-MS/MS；化學(xué)成分

陳皮(PericarpiumCitri Reticulatae)為蕓香科植物橘(CitrusreticulataeBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣、燥濕、化痰等作用。臨床常用治胸腕脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等證?，F(xiàn)代藥理研究表明，陳皮具有升壓[1]、抗血小板聚集[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、強(qiáng)心[5]、抗休克[6]、抗過敏[7]、抗菌[8]、抗腫瘤等作用[9-15]。其主要成分為黃酮類，如橙皮苷、柚皮蕓香苷以及其他多甲氧基黃酮(如川陳皮素、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮和紅橘素等)，并含生物堿和揮發(fā)油[16-19]等。課題組利用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/Q-TOF-MS/MS)等技術(shù)對(duì)陳皮化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，共鑒定出32個(gè)化學(xué)成分。此法分離效果較好，具有較強(qiáng)的分子結(jié)構(gòu)表征能力，為今后陳皮及其同屬中藥的化學(xué)成分研究提供了較好的借鑒方法。

1 儀器與材料

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ABSCIEX Triple TOF 5600+；加拿大)；島津超高效液相色譜儀(Nexera UPLC LC-30A，日本)，含在線真空脫氣機(jī)，高壓二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；Welch C18色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm，上海月旭科技)；Sartorious BT25S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平(賽多利斯公司，德國(guó))；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher 公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)TEDIA 公司)；水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水(美國(guó)Millipore 公司)，其余試劑為分析純。陳皮由樟樹藥材市場(chǎng)提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)賴學(xué)文教授鑒定陳皮為橘(CitrusreticulataeBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子化源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍100～1 500m/z；噴霧電壓：4 500 V，霧化氣溫度：550℃，氣簾氣：50psi，霧化氣和輔助氣：50psi ；去簇電壓(DP)：80eV；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS 一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF/MS/MS 離子累積時(shí)間分別為200、100ms，CE 碰撞能量為45eV，CES碰撞能量疊加為(±15)eV，觸發(fā)二級(jí)的方法為IDA，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級(jí)的條件，滿足該條件的優(yōu)先進(jìn)行二級(jí)掃描。

2.2 液相條件

流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，以梯度洗脫，0.1～2.0min，1% B；2～5min，1%～20%B；5～25min，20%～40% B；25～33min，40%～90% B；33～37min，90% B；37.1～40.0min，10%B。采用UPLC Welch C18色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，體積流量0.25mL/min，柱溫箱控溫45℃，進(jìn)樣量2.0μL。

2.3 樣品制備及檢測(cè)

稱取陳皮藥材約50.0g，經(jīng)粉碎后過篩，精密稱取10.0g，過100目篩，放于250mL平底燒瓶中，加入水100mL，在60 ℃水浴下加熱回流提取1h，放冷后真空過濾，藥渣加入100mL水后以同樣的操作提取2次，每次1h，過濾后將濾液合并，減壓濃縮，移至100mL容量瓶?jī)?nèi)，加水定容，則為樣品原液。精密量取1mL原液，放于100mL容量瓶?jī)?nèi)，以水定容達(dá)刻度，搖勻，采用0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。然后采用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果

通過 Scifinder 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)陳皮中的化合物進(jìn)行檢索，得陳皮潛在化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。采用Analyst TF1.6 和Peakview(Version1.2，AB SCIEX)軟件對(duì)陳皮提取物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。依據(jù)測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量與理論精確相對(duì)分子質(zhì)量的偏差小于 5×106的原則，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式，在已建立的陳皮化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中檢索匹配的化合物。

本實(shí)驗(yàn)共鑒定出陳皮色譜峰32個(gè)，結(jié)果見表1。然后對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別，通過二級(jí)質(zhì)譜獲得化合物的碎片信息，推測(cè)出離子裂解狀況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，區(qū)分同分異構(gòu)體。

表1 陳皮化學(xué)成分的鑒定結(jié)果

續(xù)表1 陳皮化學(xué)成分的鑒定結(jié)果

續(xù)表1 陳皮化學(xué)成分的鑒定結(jié)果

4 討論

2010年版的《中國(guó)藥典》以索氏提取法，以橙皮甙作為標(biāo)準(zhǔn)，采用石油醚脫色以及甲醇反復(fù)回流方法對(duì)陳皮成分進(jìn)行分析，但該法繁瑣，效率低。本實(shí)驗(yàn)基于化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，分析了陳皮中不同化合物的質(zhì)譜行為，總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律，從陳皮提取物中共確定了32個(gè)化合物。該方法科學(xué)簡(jiǎn)便，可省去常規(guī)提取方法所耗時(shí)間，極大地提高了鑒定成分結(jié)構(gòu)效率，為深入研究陳皮提供了科學(xué)依據(jù)。但該法也存在不足，如無(wú)法提供化合物的幾何構(gòu)型。我們認(rèn)為今后在對(duì)中藥進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分分離之前，應(yīng)采取UHPLC/Q-TOF-MS/MS方法首先對(duì)化合物進(jìn)行全景掃描，然后對(duì)可能的新化合物進(jìn)行重點(diǎn)分離，這樣就可避免重復(fù)地分離大量已知化合物。

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(責(zé)任編輯：余 婷)

Identification of Chemical Compositions inPericarpiumCitri Reticulatae by UPLC/Q-TOF-MS/MS

Ma Lin1,Huang Xiaofang2,Ouyang Hui2,Huang Jianping3,Ye Fengyu2,Ye Xide2*

(1.Fuzhou City Maternity and Child Care Service Centre, Fuzhou 344000,China;2.Jiangxi University of Traditonal Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;3.Shanggao County in Traditonal Chinese Medicine hospital, Shanggao 336400,China)

Objective:To identify the chemical composition ofPericarpiumCitri Reticulatae by using UPLC/Q-TOF-MS/MS technology. Methods:The separation was performed on UPLC Welch C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm), with a mobile phase using 0.1% formic acid (A) and water containing acetonitrile (B) for gradient elution. Q-TOF/MS and electrospray ion (ESI) source were applied for the analysis under the negative ion mode, and the running time was 40 min. Using target compound screening method, the structures of monitored chemical constituents were identified by retention time, exact relative molecular mass, and cleavage fragments of MS/MS. Results:Thirty-two chemical compositions were separated and identified from the methanol extract ofPericarpiumCitri Reticulatae. Conclusion:UPLC/Q-TOF-MS/MS method can identify the main chemical constituents fromPericarpiumCitri Reticulatae rapidly and accurately, which develops a new strategy for identification of the chemical constituents inPericarpiumCitri Reticulatae.

PericarpiumCitri Reticulatae; UPLC/Q-TOF-MS/MS; Chemical Composition

2015-05-10

江西省衛(wèi)生廳課題(2013A031)；江西中醫(yī)藥大學(xué)?；?ZX1014)

馬琳(1978-)，女，撫州市婦幼保健院主管中藥師，研究方向?yàn)榕R床中藥學(xué)。

葉喜德(1977-)，男，博士，江西中醫(yī)藥大學(xué)講師，研究方向?yàn)橹兴幊煞骤b定。

R284

A

1673-2197(2015)19-0033-04

10.11954/ytctyy.201519014