呂海燕,劉傳杰,黃建華

(解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫研究室,北京 100853)

結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍逐年增高。由于其潛在的臨床表現(xiàn)和早期癥狀的非特異性,40%～50%的新病例被診斷時(shí)已屬晚期,導(dǎo)致手術(shù)治愈率低[1]。對于晚期結(jié)直腸癌患者尤其是老年患者,常規(guī)化療在一定程度上雖可觀察到療效,卻不能有效地提高整體生存率。此外,化療的多重不良反應(yīng)會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此迫切需要確定新的針對結(jié)直腸癌的有效治療策略。

越來越多的證據(jù)表明[3-5],治療腫瘤需要?jiǎng)?chuàng)建有效靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞的新策略。到目前為止,所發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物非常稀少,而CD133則是目前所發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中最常見的標(biāo)志物之一[6]。由此我們選定了CD133作為針對CD133陽性結(jié)直腸癌治療研究的新靶點(diǎn)。

本研究擬進(jìn)行抗體與細(xì)胞因子活化殺傷(cytokine-induced killer,CIK)免疫細(xì)胞治療技術(shù)的融合與創(chuàng)新,構(gòu)建抗CD133/CD3雙功能特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,為開展靶向治療高表達(dá)CD133人結(jié)直腸癌的可行性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HT29和LOVO均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC),并于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

無血清細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640;GIBCO公司,美國);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;HyClone公司,新西蘭);鼠抗人CD3單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb;TaKaRa公司,日本);鼠抗人CD133-PE抗體和抗CD133(AC133)mAb(美天旎生物技術(shù)公司,德國);鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)熒光標(biāo)記抗體和同型對照IgG1(BD公司,美國);Traut’s試劑和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(SULFO-SMCC)試劑(賽默飛世爾科技公司,美國);人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK8;DojinDo公司);PD-10脫鹽層析柱(安瑪西亞公司,瑞典);人IFN-γ ELISA試劑盒(R＆D抗體公司,美國)。

1.3 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)

取健康志愿者外周靜脈血10ml,肝素抗凝,用生理鹽水1∶1稀釋后,加至淋巴細(xì)胞分離液上層,離心收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用含6%自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,加入鼠抗人CD3mAb(50ng/ml)和人重組白介素-2(1000U/ml),每2d加液補(bǔ)充人重組白介素-2,14d后,流式檢查細(xì)胞表型(CD3、CD4、CD8和CD56)后收獲CIK細(xì)胞。

1.4 CIK細(xì)胞表型的檢測

將培養(yǎng)0d和14d的CIK細(xì)胞調(diào)整濃度為5×106個(gè)/ml,各取200μl加入Falcon管中,加入鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對照IgG1單抗各5μl,混勻,在4℃暗室反應(yīng)30 min后,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 抗CD133/CD3雙特異性抗體的制備

我們按照文獻(xiàn)[7]方法制備雙特異性抗體。取鼠抗人CD3mAb(OKT3抗體)1mg溶于5倍摩爾濃度的Traut’s試劑500μl,室溫下作用1h,用PD-10柱過濾,移除未交聯(lián)的mAb;取鼠抗人CD133mAb(1mg)溶于4倍摩爾濃度的交聯(lián)劑SULFO-SMCC500ul,室溫下作用1h,用PD-10柱過濾,移除未交聯(lián)的mAb;將已交聯(lián)的兩種mAb混合后4℃過夜,制備得到抗CD133/CD3雙功能特異性抗體。雙抗體蛋白產(chǎn)物通過8%非還原、變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖、考馬斯亮藍(lán)染色檢測后,用蛋白定量BCA試劑盒檢測雙抗的蛋白含量。

1.6 抗CD133/CD3雙特異性抗體裝載CIK細(xì)胞

離心收集培養(yǎng)14d并經(jīng)表型檢測過的CIK細(xì)胞,PBS洗滌2次,按1×106個(gè)CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟笴D133/CD3雙功能特異性抗體,混勻后室溫靜置60min,PBS洗滌沒有結(jié)合上的抗體,CIK重懸培養(yǎng)液中,按一定比例加入靶細(xì)胞培養(yǎng)液中,得到抗CD133/CD3雙特異性抗體裝載的CIK(BsAb-CIK)細(xì)胞。

1.7 細(xì)胞毒作用的檢測

以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,以人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620、HT29和LOVO作為靶細(xì)胞,檢測對比BsAb-CIK細(xì)胞的殺傷作用。用健康供者的CIK細(xì)胞分別對SW620、HT29和LOVO細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)。

取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞,鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(10000個(gè)/孔),第2天分別加入CIK細(xì)胞或BsAb-CIK細(xì)胞(1×106個(gè)/50ng),以效靶比1∶1、5∶1、10∶1和20∶1的濃度(3個(gè)平行孔/濃度)共同培養(yǎng)4～6h,實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)單純CIK細(xì)胞對照組、靶細(xì)胞對照組和空白組。棄上清液,PBS漂洗細(xì)胞2次后,加入CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒中繼續(xù)培養(yǎng)4h,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶聯(lián)儀檢測450nm處吸光度A，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞殺傷作用：殺傷率（%）＝[1-A實(shí)驗(yàn)組/（ACIK對照＋A靶細(xì)胞對照）]×100%。

1.8 細(xì)胞因子檢測

取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620、HT29和LOVO，鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（10 000個(gè)/孔），第2天加入CIK細(xì)胞或BsAb-CIK細(xì)胞，以效靶比1∶1、5∶1、10∶1和20∶1的濃度共同培養(yǎng)4～6h后，收集上清液，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞INF-γ分泌水平。

1.9 裸鼠荷瘤制備實(shí)驗(yàn)

6～8周齡雌裸鼠27只，隨機(jī)分成3組：對照組、單純CIK組和BsAb-CIK細(xì)胞組。每只裸鼠右腋下皮下注射2×106個(gè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620或HT29細(xì)胞，10d后腫瘤長到約0.3cm×0.3cm×0.17cm大小，治療組分別在每只裸鼠腹腔內(nèi)注射CIK或BsAb-CIK細(xì)胞1×107個(gè)，6d后再次注射相同數(shù)量細(xì)胞，共2次。1個(gè)月后處死小鼠取瘤秤重，統(tǒng)計(jì)3組間腫瘤生長的差異。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)后的CIK細(xì)胞表型

結(jié)果表明在多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)14d的細(xì)胞與0d的細(xì)胞比較，CD8+/CD56+由2.65%升至11.70%，CD3+/CD8+由28.50%升至67.21%，CD3+/CD56+由3.16%升至15.92%，其中CD3+/CD8+和CD3+/CD56+細(xì)胞比率明顯升高，表明CIK細(xì)胞主要成分是具有殺傷作用的淋巴細(xì)胞，包括T細(xì)胞和NKT細(xì)胞（圖1）。

2.2 構(gòu)建抗CD133和抗CD3的雙特異性功能抗體

在溫和的條件下將小鼠抗人CD133和CD3mAb進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，制備抗CD133/CD3雙特異性抗體。通過8%非還原、變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測，證實(shí)抗CD133/CD3兩種抗體偶聯(lián)的二聚體蛋白條帶為300kD，而單體為150kD（圖2）。

2.3 結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞中CD133的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀對7種結(jié)直腸癌細(xì)胞株的CD133表面抗原進(jìn)行檢測，篩選出高、低表達(dá)CD133的配對細(xì)胞株。其中SW620表達(dá)CD133的陽性率為99.43%，HT29為66.67%，LOVO為2.92%（圖3）。

2.4 BsAb-CIK細(xì)胞體外殺傷CD133高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞系

用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同效靶比條件下（1∶5，1∶10，1∶20），BsAb-CIK細(xì)胞對高表達(dá)CD133的結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620和HT29的殺傷作用均明顯高于單純CIK組（P＜0.05），而BsAb-CIK細(xì)胞對低表達(dá)CD133的結(jié)直腸癌細(xì)胞系LOVO的殺傷作用與單純CIK組相比，沒有顯著性差異（P＞0.05）。無論是CIK細(xì)胞還是BsAb-CIK細(xì)胞，其殺傷靶細(xì)胞的作用與效應(yīng)細(xì)胞的濃度均呈正相關(guān)（圖4）。

圖1 培養(yǎng)0d和14d的健康人CIK細(xì)胞表型Figure 1 The phenotype of the CIK cells from the healthy individual on day 0 and day 14

圖2 CD133/CD3兩種抗體偶聯(lián)的二聚體蛋白Figure 2 Production of anti-CD3/ anti-CD133 BsAb

2.5 細(xì)胞因子INF-γ的分泌水平

各組培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子均伴有INF-γ分泌水平明顯增高，BsAb-CIK細(xì)胞與單純CIK組比較差異顯著（P＜0.05；圖5）。表明BsAb-CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與INF-γ分泌水平密切相關(guān)。

2.6 BsAb-CIK細(xì)胞對裸鼠體內(nèi)移植瘤的殺傷

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，與單純CIK治療組比較，BsAb-CIK細(xì)胞對小鼠SW620和HT29細(xì)胞皮下移植瘤的生長抑制作用更加顯著（P＜0.05；表1）。

3 討 論

目前，CD133已經(jīng)確定為結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志分子[10,11]。由于直接作用于腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）還沒有問世[12,13]，而單純CIK細(xì)胞又不能靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞，所以我們利用mAb的靶向殺傷作用和CIK細(xì)胞所具有的非主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性強(qiáng)大殺瘤活性的特性，構(gòu)建了BsAb-CIK新型效應(yīng)細(xì)胞。

圖3 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系CD133的表達(dá)Figure 3 Expression of CD133 in human colorectal cancer cell lines

本研究通過用抗CD133抗體對7種人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞株的CD133抗原表達(dá)的篩查后，選擇了高低配對細(xì)胞株作為靶細(xì)胞。結(jié)果表明CIK細(xì)胞在裝備了抗CD133/CD3雙抗體之后，不僅發(fā)揮了CIK廣譜直接殺傷腫瘤細(xì)胞的治療作用，而且利用雙功能抗體的橋聯(lián)作用將效應(yīng)細(xì)胞和高表達(dá)CD133的腫瘤靶細(xì)胞有機(jī)地結(jié)合到一起，形成殺傷組合體，發(fā)揮了抗體靶向打擊消滅CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞的強(qiáng)大作用。雙特異性抗體不僅將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用，與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向性的殺傷。由于抗體對抗原的識別不需要抗原提呈及MHC的表達(dá)，因此CIK裝載特異性雙抗的治療方案不但能夠有效地解決腫瘤干細(xì)胞對宿主免疫監(jiān)視逃逸和耐藥性等影響療效的關(guān)鍵難題，而且能夠修補(bǔ)CIK細(xì)胞免疫治療不能消滅具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的種子——腫瘤干細(xì)胞的缺陷。我們的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果是一致的[14]。由此可以推測BsAb-CIK新型效應(yīng)細(xì)胞不僅能夠?qū)D133高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行高效打擊，而且也有可能對各種腫瘤中的高表達(dá)CD133的干細(xì)胞細(xì)胞亞群進(jìn)行有效抑制。這一靶向殺傷CD133陽性細(xì)胞的治療方案有可能對如何消滅腫瘤干細(xì)胞、從源頭上解決腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、根治腫瘤提供了新的線索與論據(jù)。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BsAb-CIK對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與INF-γ分泌水平密切相關(guān)。IFN-γ可以促進(jìn)naiveCD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，同時(shí)還具有抑制naiveCD4+T向Th2細(xì)胞分化的功能，提示了BsAb-CIK細(xì)胞是通過增強(qiáng)抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷腫瘤作用。

總之，我們的研究表明抗BsAb-CIK細(xì)胞能夠有效的靶向殺傷CD133高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。這一研究結(jié)果為創(chuàng)建高效靶向消滅CD133陽性腫瘤干細(xì)胞的新型免疫治療策略與方案提供了重要科學(xué)論據(jù)，為深入探討增效殺瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖4 CIK和BsAb-CIK細(xì)胞殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞系Figure 4 The killing effect of CIK and BsAb-CIK cells on the human colorectal cancer cell lines (n＝3)

圖5 CIK組和BsAb-CIK組INF-γ分泌水平Figure 5 Secretion level of INF-γ in CIK group and BsAb-CIK group (n＝3)

表1 各組移植瘤經(jīng)治療后腫瘤瘤重比較Table 1 Comparison of tumor weight after treatment in each group(n＝9, g, ±s)

表1 各組移植瘤經(jīng)治療后腫瘤瘤重比較Table 1 Comparison of tumor weight after treatment in each group(n＝9, g, ±s)

Compared with CIK group, *P＜0.05

Cell line Control group CIK group BsAb-CIK group SW620 3.74±0.09 2.80±0.11 1.54±0.12*HT29 1.42±0.18 0.72±0.23 0.43±0.18*

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