孫正偉，馬蓉，徐福霞，徐漢杰，趙衛(wèi)東

[1.安徽省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230041；2.安徽省婦幼保健院婦產(chǎn)科；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)婦產(chǎn)科]

婦科癌癥中死亡的主要原因之一是卵巢癌。大多數(shù)病例是隱匿發(fā)病，且沒有準(zhǔn)確有效的早期診斷方法。確診后，70% 至80% 的患者已為晚期。目前，臨床上治療卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)方法是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和基于鉑類和紫杉醇的術(shù)后聯(lián)合化療。但是，由于腫瘤細(xì)胞存在多重耐藥性，卵巢癌5 年生存率僅僅只達(dá)30%[1]。多藥耐藥性已成為有效治療卵巢癌的主要障礙。為了改善卵巢癌的預(yù)后，對多藥耐藥機(jī)制的研究已成為關(guān)鍵。近年來，涉及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對化學(xué)療法耐受性的微小RNA(microRNAs)的研究成為熱門話題。對于卵巢癌，如miR-20a[2]，miR-137[3]，miR-205[4]和miR-519a[5]等已報(bào)道與化療耐藥有關(guān)。最近的研究[6]表明miR-193a-3p 參與CD44+胃癌細(xì)胞中順鉑耐受性的調(diào)節(jié)。還未見關(guān)于miR-193a-3p 是否參與卵巢癌多藥耐藥性機(jī)制的研究報(bào)道。這項(xiàng)研究通過MTT 分析篩選出多藥敏感卵巢癌細(xì)胞系及多藥耐藥卵巢癌細(xì)胞系。qRT-PCR檢測miR-193a-3p 在上述兩種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)，探討miR-193a-3p 與卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥的關(guān)系及其作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌細(xì)胞系HO8910，ES-2 和SKOV-3 來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；A2780細(xì)胞系來自北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS，美國Invitrogen公司生產(chǎn))，McCoy's 5A，RPMI Medium-1640，DMEM(美國Gibco 公司生產(chǎn))；MTT(美國Sigma 公司生產(chǎn))；紫杉醇(Pa，哈爾濱藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn))，順鉑(Ci，江蘇豪森制藥有限公司生產(chǎn))，卡鉑(Kp，齊魯制藥有限公司生產(chǎn))，多西紫杉醇(Dt，江蘇恒瑞制藥有限公司生產(chǎn))和依托泊苷(It，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))；miR-193a-3p mimic，miR-193a-3p 引物，the scramlble sequence(NC，negative control)和轉(zhuǎn)染試劑ribo FECTTMCP 轉(zhuǎn)染試劑盒購于廣州瑞博生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用包含10%FBS 的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3 和ES-2，使用包含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞系HO8910，并用RPMI Medium-1640 培養(yǎng)細(xì)胞系A(chǔ)2780，均培養(yǎng)在5%二氧化碳(CO2)，37 °C 的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 MTT 法檢測四種卵巢癌細(xì)胞對五種化療藥的IC50值 對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞系經(jīng)胰酶消化并接種在96 孔板中。經(jīng)24 h 細(xì)胞貼壁，將五種化療藥(順鉑，紫杉醇，多西紫杉醇，卡鉑和依托泊苷)添加到五種梯度濃度中的每一種中。經(jīng)72 h 孵育后，向每個(gè)孔中添加20 μL(5 mg/mL)MTT 試劑，并繼續(xù)在孵育箱中孵育4 h。除去培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO 以溶解甲瓚，然后輕輕搖動(dòng)振蕩器10 min 以完全溶解甲瓚。酶標(biāo)儀使用波長570 nm 來測量吸光度(OD)值。通過Msvbvm50 軟件計(jì)算與每種細(xì)胞的50%抑制率相對應(yīng)的藥物及濃度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 遍。

1.2.3 定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)法檢測miR-193a-3p表達(dá) 用Trizol 法從卵巢癌細(xì)胞中提取5 μg 的總RNA 與10 nm dNTPS 1 μL 和100 nm Oligo-dT 1 μL混合。在65℃下加熱5 min 后，立即將其置于冰上2 分鐘。加入反轉(zhuǎn)錄混合物(5 X RT 緩沖液4 μL，0.1 mm DTT 2 μL，Rnase 抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶50 u)，在42 °C 反應(yīng)50 min 以合成cDNA。通過在70 ℃下加熱10 min 來終止反應(yīng)，并在-20 ℃下保存。使用SYBR Green 方法在定量實(shí)時(shí) PCR 儀器(FTC-3000P，加拿大豐凌生物技術(shù)有限公司)中檢測miR-193a-3p 的表達(dá)水平。

1.2.4 miR-193a-3p mimic 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前，將卵巢癌細(xì)胞接種并在6 孔板中培養(yǎng)，以達(dá)到30%至50%的細(xì)胞密度。對每個(gè)孔的轉(zhuǎn)染樣品制備：用120 μL 1 X Ribo FECTTMCPBuffer 稀釋20 μM miR-193a-3pNC/ mimic 5 μL。輕輕搖勻，加入Ribo FECTTMCP 試劑12 μL，吹打輕輕混勻，然后在室溫下孵育15 min。將上述混合液體添加到1863 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基中并輕輕混合。將培養(yǎng)板放置在37 °C 的CO2培養(yǎng)箱中24 h，用于從細(xì)胞中提取總RNA 并接種96 孔板，用于化療藥物對卵巢癌細(xì)胞的MTT 實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 遍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，α=0.01 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)之間的miR-193a-3p 表達(dá)差異及在ES-2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC 和miR-193a-3p mimic 后的miR-193a-3p 表達(dá)差異以及ES-2 細(xì)胞對四種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇和依托泊苷)中每種藥物耐受性的變化差異，均應(yīng)用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測五種化療藥對細(xì)胞系HO8910，ES-2，A2780，SKOV-3 的IC50值 用MTT 法測定五種化療藥(紫杉醇、卡鉑、順鉑、多西紫杉醇和依托泊苷) 對四種卵巢癌細(xì)胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除順鉑后，從剩余的四種化療藥中篩選出ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)。兩種卵巢癌細(xì)胞系的具體值見表1。

表1 五種化療藥對ES-2 及SKOV-3 的IC50值

2.2 miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)中的表達(dá) 結(jié)果表明，其在卵巢癌細(xì)胞系ES-2中低表達(dá)，而在卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3 中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.41，P ＜0.01)。如圖1所示。

圖1 qRT-PCR 方法檢測miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)中的表達(dá)

2.3 miR-193a-3p mimic 可提高ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對三種化療藥的耐藥性 與NC 組 相 比，轉(zhuǎn) 染 了 miR-193a-3p mimic 組 中miR-193a-3p表達(dá)顯著升高(t=57.73，P ＜0.01)，如圖2 所示。在轉(zhuǎn)染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通過MTT 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對四種化療藥(紫杉醇、卡鉑、多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性。結(jié)果表明，與NC 組相比，轉(zhuǎn)染了miR-193a-3p mimic 組中，ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對三種化療藥(紫杉醇、卡鉑、多西紫杉醇)的耐藥性顯著提高(除依托泊苷外)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6. 05，P ＜0.01；t=4.23，P ＜0.01；t=9.19，P ＜0.01)，如圖3 所示。

圖2 qRT-PCR 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)轉(zhuǎn)染NC 及miR-193a-3p mimic 后miR-193a-3p 的表達(dá)

圖3 MTT 方法檢測在ES-2 (相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)中轉(zhuǎn)染NC 和miR-193a-3p mimic 后對四種化療藥的敏感性

3 討論

目前，有效治療卵巢癌的主要障礙為化療耐藥，特別是多藥耐藥[7-8]。近年來，對卵巢癌化療耐藥機(jī)制的研究成為一個(gè)熱門話題[9]。例如，MicroRNAs(miRNAs)是一組非編碼的小RNA，它們在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和代謝以及多藥耐藥等[10]。而有關(guān)miR-193a-3p 的研究團(tuán)隊(duì)表明，miR-193a-3p可以通過在體內(nèi)外抑制SRSF2，PLAU，LOXL4，HIC2，HOXC9，ING5 和PSEN1 的表達(dá)來調(diào)節(jié)NF-kB，DNA 損傷，Oxidative stress，Notch 和Myc/max 五個(gè)信號通路，提高了膀胱癌對多種化療藥的耐藥性[11-12]，并初步證實(shí)miR-193a-3p 的表達(dá)同4種化療藥(吡柔比星，阿霉素，羥基喜樹堿和鹽酸表柔比星)的耐藥性密切相關(guān)，而最近有研究[6]報(bào)道，miR-193a-3p 參與CD44+胃癌細(xì)胞對順鉑的耐藥機(jī)制調(diào)節(jié)。目前為止，有關(guān)miR-193a-3p 在卵巢癌化療耐藥中的機(jī)制研究較少。

在這項(xiàng)研究選擇了四種卵巢癌細(xì)胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)作為研究對象，并依據(jù)最新的NCCN 指南從第一線化療藥中選擇了順鉑、卡鉑和紫杉醇。并從第二線化療藥中選擇了依托泊苷和多西紫杉醇。用MTT 法測定5 種化療藥(紫杉醇、卡鉑、順鉑、多西紫杉醇和依托泊苷)對4種卵巢癌細(xì)胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除順鉑后，從剩余的四種化療藥中篩選出ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)。用qRT-PCR 檢測miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細(xì)胞系)中的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-193a-3p在卵巢癌細(xì)胞系ES-2 中低表達(dá)，而在卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3 中高表達(dá)。于是，將NC 和miR-193a-3p mimic 轉(zhuǎn)染到ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)中，并使用qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率，與NC 組相對比，轉(zhuǎn)染了miR-193a-3p mimic 組中miR-193a-3p表達(dá)相對增加約3 258 倍。進(jìn)而，在轉(zhuǎn)染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通過MTT 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對4 種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性，與NC 組相對比，轉(zhuǎn)染了miR-193a-3p mimic 組中，ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對3 種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇)的耐藥性顯著提高(除依托泊苷外)。這與關(guān)于胃癌[6]、肝細(xì)胞肝癌[13]和膀胱癌[11-12]的文獻(xiàn)中的報(bào)道結(jié)果相似。未來的研究重點(diǎn)在于：進(jìn)一步探究miR-193a-3p 是通過作用哪些下游的蛋白編碼基因來參與卵巢癌的多藥耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)。

綜上所述，miR-193a-3p mimic 可以增加ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細(xì)胞系)對卡鉑，紫杉醇和多西紫杉醇的耐藥性。這可能為判斷卵巢癌患者的預(yù)后提供新的分子標(biāo)志物，并選擇敏感的化療藥，可能為將來對卵巢癌的多藥耐藥性或基因靶向治療的基礎(chǔ)或臨床研究提供新思路。