余鴻標(biāo)，姚吉龍

(1.深圳市羅湖醫(yī)院 婦科，深圳 羅湖 518000;2.深圳市婦幼保健院 婦科，深圳 福田 518000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，Ems)是一種生育期婦女常見的疾病，指腺體和間質(zhì)等子宮內(nèi)膜組織在子宮肌層以外的位置出現(xiàn)生長(zhǎng)和浸潤(rùn)，可導(dǎo)致痛經(jīng)乃至不孕，發(fā)生率為10%～15%［1－2］。Ems具有明顯的家族聚集性，患者的直系親屬患病率是無(wú)家族史患者的6 ～7 倍［3］。有研究證實(shí)腫瘤壞死因子(TNF)與其它促血管生成因子之間的相互作用能夠共同促進(jìn)新血管生成，而血管的建立和維持是Ems 發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。腫瘤壞死因子β(TNF-β)是體內(nèi)T 細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴毒素，基因位于HLA-β 和HLA-C2 之間，與MHC 基因及TNF-α 基因緊密連鎖［4］。TNF-β 基因+252 位點(diǎn)的等位基因G/A 位于第1 啟動(dòng)子，與限制性內(nèi)切酶的識(shí)別密切相關(guān)，是TNF-β 基因上最主要的多態(tài)性位點(diǎn)。本研究通過測(cè)定TNF-β 基因+252 位點(diǎn)的基因多態(tài)性和血清中TNF-β 的含量，分析Ems 與TNF-β G252A 基因之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2013 年7 月～2014 年7 月經(jīng)腹腔鏡和病理確診的Ems 患者80 例作為Ems 組，根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～ Ⅳ期35例;21 ～40 歲，平均(30.15±5.25)歲。需經(jīng)腹腔鏡等手段排除Ems 的適齡婦女80 例作為對(duì)照組，22 ～41 歲，平均(30.17±5.20)歲。全部受試者間均為無(wú)血緣關(guān)系，飲食結(jié)構(gòu)相似，兩組受試者基礎(chǔ)資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。排除糖尿病疾病、腫瘤、甲狀腺肝腎功能不全及嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良并使用過激素治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 TNF-β 的含量測(cè)定［6］全部受試者均采用腹腔鏡在空腹時(shí)抽取靜脈血3 mL，3 500 r/min 離心10 min 后收集上清，分2 ～3 管置－70 ℃保存。采用TNF-β 酶聯(lián)免疫試劑盒(購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)按照說(shuō)明檢測(cè)血清中TNF-β 含量，每份標(biāo)本做2 個(gè)副孔孔。

1.2.2 TNF-β G252A 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)［7］采用酚－氯仿法提取白細(xì)胞中的DNA［8］，設(shè)計(jì)并合成(大連寶生物工程有限公司)PCR 引物［11］。TNF-β G252A 上游引物為5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3'，下游引物為5'-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3'。PCR 體系50 μL(含10×緩沖液6 μL，2 mol/μL 的dNTP 3 μL，上、下游引物濃度0.4 mol/L，基因組DNA 0.1 μg，Taq DNA 聚合酶2U)。循環(huán)條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。結(jié)果判定:出現(xiàn)555 bp、185 bp 兩條帶為G 等位基因純合子(TNF-β 1/1 型);555 bp、185 bp、740 bp 3 條帶為G/A 雜合子(TNF-β 1/2 型);僅出現(xiàn)740 bp一條帶為A 等位基因純合子(TNF-β 2/2 型)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TNF-β 含量與EMT 分期的相關(guān)性

Ems 組血清中TNF-β 含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);Ems 組Ⅲ、Ⅳ期患者血清TNF-β 含量明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);見表1。Ems 組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(guān)(r=0.853 2)。

表1 子宮內(nèi)膜異位癥組與對(duì)照組血清TNF-β 含量Tab.1 The levels of TNF-β in Ems group and the control group

2.2 TNF-β G252A 位點(diǎn)多態(tài)性及分布

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示Ems 組和對(duì)照組均檢出TNF-β G252A 位點(diǎn)G/A 突變。TNF-β G252A 多態(tài)位點(diǎn)不同基因型如圖1 的電泳圖譜所示。兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，A/A基因型及G/A 基因型頻率在Ems 組中均高于對(duì)照組。而A/A 基因型患內(nèi)異癥的危險(xiǎn)度是G/G 基因型的3.5 倍。見表2。

圖1 TNF-β G252A 位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophorersis results of PCR product of TNF-β G252 gene

表2 Ems 組與對(duì)照組TNF-β G252A 位點(diǎn)基因型頻率Tab.2 Comparison of genotypic frequencies of TNF-β 252 gene between Ems group and control group

3 討論

Ems 是一類良性腫瘤，但具有能夠侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。對(duì)于TNF 基因與Ems 之間的關(guān)系，學(xué)說(shuō)眾多卻均無(wú)定論。因此，探明其中的關(guān)系，對(duì)于Ems 的診斷、治療及預(yù)后方面將有重大意義［1－2］。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組血清中測(cè)得TNF-β 含量顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期(P ＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組血清中TNF-β 的含量與EMT 分期之間正相關(guān)(r=0.853 2)。這可能是因?yàn)門NF 是重要的血管生成因子，可促進(jìn)內(nèi)膜異位灶的血管形成和盆腔粘連［5］。在Ems 早期TNF-β 可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-1、IL-6 等炎癥介質(zhì)調(diào)控并促使種植灶中新生血管的生長(zhǎng)、分化，最終形成內(nèi)異癥病灶。過量的TNF 又可降低機(jī)體的免疫狀態(tài)，使得Ems 進(jìn)一步發(fā)生、發(fā)展。因此，會(huì)伴隨著Ems 病情的加重，患者體內(nèi)血清中TNF-β 的濃度會(huì)逐步增高。

此外，兩組間各基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，A/A 基因型及G/A 基因型頻率在實(shí)驗(yàn)組中均高于對(duì)照組。而A/A 基因型患Ems 的危險(xiǎn)度是G/G 基因型的3.5 倍。說(shuō)明等位基因A 將使Ems 的患病概率明顯增加，與張良等［9］的報(bào)道一致，但與車?yán)ぬm等［10］報(bào)告的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間無(wú)差異結(jié)果不同。主要原因在于單一基因?qū)ms發(fā)病的作用，更多的受到了種族、生存環(huán)境、飲食習(xí)慣等因素的影響，探究多基因同疾病的關(guān)系更具借鑒意義。

綜上，Ems 患者血清中TNF-β 的含量與EMT的分期呈正相關(guān)，A/A 基因型是患Ems 的危險(xiǎn)基因型。但是由于單一基因?qū)ms 發(fā)病的作用會(huì)受到了種族、生存環(huán)境、飲食習(xí)慣等因素的影響，同時(shí)存在研究樣本量偏少等問題，需要進(jìn)一步加大樣本量研究。

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