歐海龍 張禮林 何曉蘭 李紅梅 雷霆雯

摘要：ApoE-/-基因敲除小鼠（ApoE-/-）經(jīng)含有21%脂肪和0.15%膽固醇的高脂飼料喂食12周后進(jìn)行各項(xiàng)血脂膽固醇水平檢測(cè)，以及整體主動(dòng)脈油紅0染色與主動(dòng)脈根部病理切片油紅0染色等動(dòng)脈粥樣硬化病理分析。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠的血漿總膽固醇和甘油三酯水平均比未經(jīng)飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠、經(jīng)同樣飲食處理的野生型小鼠以及未經(jīng)處理的野生型小鼠均顯著升高（P<0.05）；低密度脂蛋白-膽固醇水平與野生型（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多；高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積占整體主動(dòng)脈面積的65%，顯著高于ApoE-/-小鼠的正常飲食組（21%）（P<0.05），同時(shí)主動(dòng)脈根部的血管壁明顯增厚，管腔變窄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)高脂飼料飲食誘導(dǎo)，成功建立了動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠，可為下游的藥物篩選、基因治療以及動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)理的體內(nèi)研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料。關(guān)鍵詞：ApoE-/- 小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化；膽固醇；血脂；主動(dòng)脈中圖分類號(hào)：R394 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）02-0141-04The Establishment of Atherosclerosis Model in ApoE-/- MiceOU Hai-long， ZHANG Li-lin，HE Xiao-lan， LI Hong-mei， LEI Ting-wen（Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical University， Guiyang 550004， Guizhou， China）Abstract ： The ApoE gene knockout mice （ApoE-/-） were fed with a high-fat （HF） diet containing 21% fat and 0.15% cholesterol for 12 weeks to establish atherosclerosis model. After diet induction， the ApoE-/- mice were sacrificed and plasma total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low -density lipoprotein -cholesterol （LDI-C） and high-density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） levels were measured. The whole aortas and sequential sections of the aortic root were stained with oil red 0. Results showed that the plasma levels of TC and TG from HF diet induced ApoE-/- mice were both dramatically higher than normal diet（ND）-fed ApoE-/- mice as well as wild-type mice fed with normal diet or HF diet （P <0.05）. The contents of LDL-cholesterol in plasma were elevated by three-fold compared with wild-type （ND and HFD）. Atherosclerotic lesion sizes were significantly increased in whole aorta （65%） as compared with normal diet ApoE-/-mice （21%）. Similar result was obtained from cross -sections of the aortic root analysis. The results demonstrated that HF diet treatment greatly enhanced atherosclerosis development in ApoE-/-mice. The establishment of atherosclerosis model mice provides a valuable tool for drug screen， gene therapy and even in vivo mechanism analysis in atherosclerosis disease.Key words ： ApoE-/-mice； atherosclerosis； cholesterol； lipoprotein； aorta（Life Science Research， 2015， 19（2）：141 ?144）體內(nèi)的脂類物質(zhì)代謝異常時(shí)，多余的脂質(zhì)沉積在血管壁上，并逐漸形成斑塊，使血管內(nèi)皮增厚、變硬，是引起動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis AS）的重要原因之一。載脂蛋白E（apo；ipoprotein E，apoE） 主要存在于乳糜微粒（chylomicrom，CM）、極低密度脂蛋白（verylowdesitylipoprotein，LDL）等多種血漿脂蛋白中，可介導(dǎo)脂蛋白殘粒的攝取，維持血漿膽固醇的平衡、促進(jìn)泡沫細(xì)胞中膽固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，該基因缺陷將使體內(nèi)脂代謝發(fā)生紊亂。ApoE基因敲除的純合小鼠（ApoE-/-）可正常存活和繁殖，當(dāng)給予適當(dāng)?shù)母咧嬍硶r(shí)，可導(dǎo)致各種高脂蛋白血癥[1.2]，是動(dòng)脈硬化研究的常用工具。本研究以C57BL/6純系的ApoE-/-小鼠為材料，通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導(dǎo)其形成動(dòng)脈粥樣硬化病變小鼠模型，該模型可為下游的藥物篩選、基因治療以及動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)理的體內(nèi)研究提供理想的試驗(yàn)材料。1材料與方法1.1試劑和儀器體視顯微鏡（江南永新，南京），倒置顯微鏡（TS100F，Nikon公司，日本），冰凍切片機(jī)（CM1850，Leica公司，德國(guó)）；小鼠基礎(chǔ)飼料由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；尹紅、蘇木素購(gòu)自北京賽弛生物公司；油紅0購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2試驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6純系背景的載脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-）購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，引種協(xié)議[2012]470號(hào)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件為室溫20-25℃，相對(duì)濕度40%～70%。對(duì)6周齡左右的雄性（ApoE-/-小鼠（n=8）進(jìn)行高脂肪飼料喂養(yǎng)（21%脂肪和0.15%膽固醇），喂食12周之后，對(duì)體重為25?30g的小鼠進(jìn)行解剖并抽取靜脈血用于下一步實(shí)驗(yàn)。1.3血脂水平的檢測(cè)方法血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三月脂（Triglyceride，TG）水平的測(cè)定分別采用膽固醇氧化酶法（C0D-PAP）及磷酸甘油氧化酶法（GP0-PAP），最后通過(guò)分光光度計(jì)在500nm測(cè)得吸收值。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測(cè)定方法均按照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。1.4主動(dòng)脈整體染色方法小鼠采血后，在麻醉下用PBS進(jìn)行灌注，分離獲得整體主動(dòng)脈，清除其余脂肪和結(jié)締組織后，用PBS清洗干凈，于4%多聚甲醛中固定12h以上，再縱向剖開(kāi)。主動(dòng)脈經(jīng)70%乙醇中浸泡2min后進(jìn)行油紅0染色30min（用異丙醇配成0.5%的母液，再以3：2的比例稀釋成工作液）；70%乙醇漂洗至組織發(fā)白，經(jīng)蒸餾水清洗數(shù)次后拍照，并用Image-Pro Plus 6.0.（IPP6.0）軟件（Media Cybernetics）對(duì)斑塊面積進(jìn)行定量分析。1.5主動(dòng)脈根部斑塊組織化學(xué)分析方法取出心臟固定48h后，從心耳下方切取主動(dòng)脈根部，再進(jìn)行蔗糖脫水，0CT（Optimal cutting temperature compound）包埋。快速冷凍之后從主動(dòng)脈瓣開(kāi)始以100μm為間距切取連續(xù)5張厚度為8μm的切片。切片進(jìn)行油紅0染色。染色方法同1.4。1.6統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。各組數(shù)據(jù)之間顯著性檢驗(yàn)用多個(gè)樣本均數(shù)比較及兩兩比較的t檢驗(yàn)分析。2結(jié)果2.1 血脂檢測(cè)ApoE-/-小鼠在高脂飼料飲食誘導(dǎo)12周后，取靜脈血進(jìn)行TC、TG、LDL-C和HDL-C水平檢測(cè)。結(jié)果顯示經(jīng)高脂誘導(dǎo)小鼠的TC和TG含量比未經(jīng)誘導(dǎo)的野生型和ApoE-/--小鼠，以及經(jīng)高脂誘導(dǎo)的野生型小鼠均顯著升高（P<0.05）（表1），其中比未經(jīng)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠的TC含量提高了50%。高脂組ApoE-/-小鼠的LDL-C水平比其他三組對(duì)照小鼠也存在不同程度的提高，特別是與野生型（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多；HDL在體內(nèi)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其水平與正常飲食的ApoE-/-小鼠相比有顯著升高，但與野生型（正常飲食組和高脂組）相比變化相對(duì)較小（表1）。2.2動(dòng)脈粥樣硬化的病理分析對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行解剖，獲取主動(dòng)脈，通過(guò)油紅0染色的方法確定脂質(zhì)在整體主動(dòng)脈壁上的積累程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飼料飲食誘導(dǎo)后ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈以及髂總動(dòng)脈分支處均可見(jiàn)明顯的粥樣硬化斑塊，斑塊內(nèi)的脂質(zhì)被油紅0染成紅色，其陽(yáng)性比例高達(dá)65%，比未經(jīng)誘導(dǎo)處理的同窩出生的小鼠（21%）顯著升高（P<0.05）（圖1）。同時(shí)，獲取主動(dòng)脈根部，經(jīng)冷凍切片后進(jìn)行油紅0染色。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)果與整體主動(dòng)脈染色的相似，在經(jīng)高脂飼料飲食誘導(dǎo)后小鼠中，其主動(dòng)脈根部的血管壁明顯增厚，紅色脂質(zhì)沉積在管壁面上，使管腔狹窄，而未經(jīng)處理的ApoE-/--小鼠的斑塊面積占動(dòng)脈總面積的比例相對(duì)較小（圖2）。3討論小鼠對(duì)膽固醇表現(xiàn)出比人類更強(qiáng)的耐受力，發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的進(jìn)程和病變好發(fā)部位與人類也均有一定的差異，所以曾一度被認(rèn)為不適合作為動(dòng)脈粥樣硬化研究的模式動(dòng)物[3.4]。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)C57BL/6背景的小鼠品系對(duì)膽間醇相對(duì)較為敏感，特別是Piedrahita等在1992年成功制備出的C57BL/6背景的ApoE基因敲除小鼠，當(dāng)其給予高脂飲食，較易誘發(fā)AS而且病變進(jìn)程與人類的相似，可發(fā)展至平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)等中晚期粥樣病變[5.6]。再加上小鼠本身易于繁殖，飼養(yǎng)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，使ApoE-/-小鼠取代之前常用的兔、大鼠、豬等動(dòng)物，成為近年來(lái)進(jìn)行AS研究的主要模式動(dòng)物。在20世紀(jì)60年代，人們采用30%脂肪、5%膽固醇和2%的膽汁酸成功誘導(dǎo)出C57BL/6的AS小鼠，但是該飼料對(duì)小鼠不是很健康，易使小鼠體重減輕、并發(fā)呼吸系統(tǒng)感染等炎癥反應(yīng)。1985年P(guān)aigen等對(duì)上述飼料進(jìn)行了改進(jìn)，發(fā)明了“Paigen飼料”包括15%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%的膽汁酸，降低了原飼料的毒性，并取得不錯(cuò)的誘導(dǎo)效果[7]。之后人們?cè)谏鲜鲲暳系幕A(chǔ)上對(duì)其成分和比例進(jìn)行再次調(diào)整，制備出了更為健康的飼料（21%脂肪和0.15%膽固醇），由于與美國(guó)人的飲食習(xí)慣較為接近，被稱為“西方型”詞料。本研究中我們采用該飼料對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)3個(gè)月的誘導(dǎo)后，高脂誘導(dǎo)小鼠的TC含量比未經(jīng)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠上升了50%；LDL-C水平與野生型相（正常飲食組和高脂組）相比升高了近3倍多。主動(dòng)脈斑塊面積占整體主動(dòng)脈的面積比提高了近60%，AS病變效果顯著。該小鼠可為AS的多方面研究提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：藥物篩選；分子干預(yù)，如基因治療等；以及AS相關(guān)的病理機(jī)制研究，比如分析在AS病變下的生理特征、相關(guān)基因表達(dá)譜的改變等。主動(dòng)脈整體染色可以非常直觀地反應(yīng)出AS的病變程度，是AS研究中常用的一種分析手段，但在具體操作細(xì)節(jié)上根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)材料稍有差異。有的研究者在獲取小鼠整體主動(dòng)脈之后不進(jìn)行甲醛固定或縱向切開(kāi)后再進(jìn)行固定[8]。本實(shí)驗(yàn)則采用立即固定的方法，主要是由于小鼠動(dòng)脈管比較嫩，固定后就會(huì)變得堅(jiān)韌，這有利于血管外周粘附著豐富的脂肪以及血管的剖開(kāi)等操作。染色之后，在觀察主動(dòng)脈并拍照時(shí)，人們通常利用細(xì)針將經(jīng)縱向切開(kāi)后的血管固定在蠟板上，使其展現(xiàn)出內(nèi)膜，這在大動(dòng)物上較易操作。小鼠主動(dòng)脈較細(xì)，通過(guò)細(xì)針展現(xiàn)內(nèi)膜的方法不好操作；本研究將剖開(kāi)后的血管貼在透明膠布上，實(shí)驗(yàn)證明該方法可以很方便地將血管平面展開(kāi)，內(nèi)膜暴露，而不必借助于細(xì)針。主動(dòng)脈根部是小鼠AS病變的好發(fā)部位，對(duì)該位置的病理分析已成為小鼠AS程度評(píng)價(jià)的一個(gè)主要指標(biāo)。在對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行切片制作時(shí)，我們認(rèn)為取材最為關(guān)鍵。解剖獲得心臟之后，在緊貼心臟處，垂直于動(dòng)脈瓣的方向切斷升主動(dòng)脈，保證使3個(gè)動(dòng)脈瓣處于同一平面上。接著包埋、切片，由于考慮到后期要進(jìn)行油紅0染色，因此本實(shí)驗(yàn)采取冷凍切片。切下的片子先不染色，在體視顯微鏡下觀察切面情況，當(dāng)出現(xiàn)主動(dòng)脈瓣結(jié)構(gòu)時(shí)，正式貼片、染色[9.10]?？傊狙芯坑煤?1%脂肪和0.15%膽固醇的高脂飼料誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠，經(jīng)12周的飲食處理后，血漿總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白指標(biāo)明顯升高，而且主動(dòng)脈斑塊顯著增多，主動(dòng)脈根部管壁增厚，表現(xiàn)出典型的動(dòng)脈粥樣硬化病理特征。該小鼠可用于下一步的藥物干預(yù)和病理機(jī)制的研究。參考文獻(xiàn)（References）：[l]PLUMP 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