賀小英 馬利兵 程騰 劉希宇 劉銷 吳飛

摘要：乳腺上皮細(xì)胞是研究泌乳的調(diào)控機(jī)理、乳腺癌發(fā)病機(jī)制以及制備乳腺生物反應(yīng)器靶細(xì)胞。由于乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)生命周期較短并且增殖活力與體外培養(yǎng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，到目前為止，能夠適合體外研究的乳腺細(xì)胞系報(bào)道較少。因此，在優(yōu)化了乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證了優(yōu)化體系后培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞生物學(xué)的穩(wěn)定性、蛋白表達(dá)情況及轉(zhuǎn)基因的效率。結(jié)果表明：1：1DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子+10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰島素+0.1mmol/L非必須氨基酸是維持乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的最適條件。在此培養(yǎng)條件獲得的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，傳代次數(shù)能延長(zhǎng)到20代，生長(zhǎng)后期仍然能穩(wěn)定表達(dá)CK18，且具有較高的轉(zhuǎn)基因效率.

關(guān)鍵詞：乳腺細(xì)胞；體外培養(yǎng)；轉(zhuǎn)基因；乳腺生物反應(yīng)器

中圖分類號(hào)：Q2-0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0019-05

Optimization of Culture Condition and Functional Verification for Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro

HE Xiao-ying*，MA Li-bing，CHENG Teng，LIU Xi-yu，LIU Juan，WU Fei

（School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 104010，Inner Mongolia，China）

Abstract：Mammary epithelia cells are an important invitro model to study the mechanism of lactation，cancer and mammary bioreactor.However，it is very hard to culture in vitro.Currently，fewer cell lines have been used in mammary research field.A valid method for the study of the mammary gland epithelium cell was established.The results showed that the media added 1：1 DMEM/F12，plus 10% FBS，2 mmol/L L-glu-tamine，10ng/mL EGF，10ng/mL FGF，10（xg/mL ITS，5μg/mL insulin and 0.1 mmol/L NAEE was the suitable media for bovine mammary epithelial cells.The mammary epithelia cells obtained under optimized condition grew vigorous，extended life span to 20 passages，steadily expressed CK18 and had high transgenic efficiency.

Keywords：mammarycells；invitroculture；transgene；mammarybioreactor（LifeScienceResearch，2015，19（1）：019-023）

乳腺細(xì)胞是研究泌乳的調(diào)控機(jī)理、乳腺癌疾病模型、乳腺生物反應(yīng)器制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等領(lǐng)域的靶細(xì)胞。到目前為止，由于乳腺上皮細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，體外培養(yǎng)較為困難。盡管現(xiàn)在已經(jīng)建立了一些永生化的牛乳腺細(xì)胞系，但是，這些細(xì)胞系除了MAC-T外[1]，其他細(xì)胞系還沒(méi)有得到別的學(xué)者檢驗(yàn)及進(jìn)一步的相關(guān)研究，而且乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系也不完善，當(dāng)采用外源基因?qū)梭w外培養(yǎng)的細(xì)胞方法來(lái)分析基因功能或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究時(shí)，要求乳腺上皮細(xì)胞能長(zhǎng)時(shí)間地體外穩(wěn)定生長(zhǎng)。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中由于培養(yǎng)環(huán)境的局限性，影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞凋亡等的信號(hào)通路發(fā)生改變，加速了細(xì)胞的死亡，這樣也局限了正常乳腺細(xì)胞的體外研究[2]。因此，探索牛乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)條件是該領(lǐng)域研究的迫切需要。本研究旨在研究牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的最適條件，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化體系后培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞生物學(xué)穩(wěn)定性、蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)基因的效率高低。

1材料與方法

1.1材料和試劑

新鮮乳腺組織取自屠宰場(chǎng)。質(zhì)粒純化試劑盒說(shuō)明書（EndofreePlasmidExtractionKit）購(gòu)自Promega公司（美國(guó)）；脂質(zhì)體2000、1：1DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液、非必需氨基（NEAA）、胎牛血清（FBS）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素蛋白轉(zhuǎn)鐵硒納（100x）（ITS）和膜島素（Insulin）購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），單克隆鼠抗角蛋白CK18、羊抗小鼠IgG-cy3二抗和DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Hoechst33342、100U/mL青霉素、100（xg/mL鏈霉素和谷氨酰胺購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。真核表達(dá)載體pEGFP-Cl購(gòu)自Clontech公司（美國(guó)）；宿主菌DH5a為本室保存。

1.2方法

1.2.1乳腺上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌狀態(tài)下取健康牛乳腺組織，采用PBS液清洗3?5遍，用眼科鑷剪成1mm3小塊，將其貼于培養(yǎng)肌中，間距0.5cm左右，倒置培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱大約2～3h左右。待組織塊與培養(yǎng)皿粘合牢固時(shí)，補(bǔ)足培養(yǎng)液，每隔3d換一次液持續(xù)培養(yǎng)，大約10?14d上皮養(yǎng)細(xì)胞遷出。待乳腺上皮細(xì)胞達(dá)90%匯合后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，加入0.25%胰酶0.04%EDTA消化8min，待胞質(zhì)回縮變圓，加入等量的含有血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液，800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按1：3的比例接種在新的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2，飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2不同培養(yǎng)條件對(duì)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

根據(jù)表1配制8種不同的細(xì)胞培養(yǎng)液。將純化的乳腺上皮細(xì)胞分成兩組，以每mL1x104個(gè)接種于12孔培養(yǎng)板，第一組培養(yǎng)6d后，消化細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按Patterson公式計(jì)算群體倍增時(shí)間T（T=tlg2/（lg/N0- lg/N1）；（N0：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末回收細(xì)胞數(shù)；N1：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的時(shí)間）。第二組進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)在8種不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的最終傳代次數(shù)。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)群體倍增時(shí)間和最終存活的代數(shù)評(píng)估8種不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)液對(duì)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，最終確定乳腺上皮細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。

1.2.3優(yōu)化條件下乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)情況檢測(cè)

首先無(wú)菌狀態(tài)下取健康牛乳腺組織，采用組織塊貼壁法，乳腺組織貼壁培養(yǎng)過(guò)程，部分組織會(huì)直接遷出乳腺細(xì)胞，顯微鏡下觀察，取出只遷乳腺細(xì)胞的組織塊，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿，以1.2.2組確定的最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，顯微鏡下觀察其生物學(xué)特性。

1.2.4優(yōu)化條件下乳腺上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白表達(dá)

以1.2.2組確定的最適培養(yǎng)條件組獲得的上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，選取第15代細(xì)胞，以1x105個(gè)細(xì)胞接種到載玻片，待細(xì)胞在載玻片匯合生長(zhǎng)后，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，然后用封閉液封閉2h，緩沖液洗滌3遍，填加1：50的鼠抗人CK18，4℃過(guò)夜，緩沖液洗滌3遍，加1：100Cy3熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫暗室1h，用1：500的Hoechst33342避光染核15min，鏡檢。

1.2.5優(yōu)化條件下pEGFP-Cl鑒定乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

嚴(yán)格按照質(zhì)粒純化試劑盒說(shuō)明書操作，純化真核表達(dá)載體pEGFP-Cl，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度為548 比值為1.86。

在上述研究的基礎(chǔ)上，選取細(xì)胞體外增殖活力較好且存活時(shí)間較長(zhǎng)的兩組為研究對(duì)象，分別選取體外培養(yǎng)的第10代細(xì)胞，待乳腺上皮細(xì)胞匯合生長(zhǎng)至75%～85%時(shí)，按脂質(zhì)體2000操作說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，DNA與脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比例是1：2|31，轉(zhuǎn)染48h后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2結(jié)果

2.1不同體外培養(yǎng)條件對(duì)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

根據(jù)群體倍增時(shí)間和最終傳代次數(shù)綜合判斷兩組乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果表明，這7種培養(yǎng)液均能維持一定時(shí)間的牛乳腺上皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)，且在早期細(xì)胞生長(zhǎng)活力差異不顯著，在血清濃度10%的條件，單一生長(zhǎng)因素對(duì)乳腺細(xì)胞的群體倍增時(shí)間較長(zhǎng)，傳代次數(shù)均較低（R1M2M3和R4）。15%的高血清濃度可延長(zhǎng)細(xì)胞體外壽命，但是群體倍增時(shí)間較長(zhǎng)（R7）：5%低血清濃度其群體倍增時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞存活時(shí)間最低（H8），H5組的群體倍增時(shí)間為34.45，細(xì)胞生長(zhǎng)活力較好，細(xì)胞能穩(wěn)定存活20代左右，為最適生長(zhǎng)條件。

2.2優(yōu)化培養(yǎng)后的乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)特征

如圖1所示，采用R5組培養(yǎng)體系培養(yǎng)乳腺組織，大約7～10d后，部分組織塊會(huì)直接遷出乳腺上皮細(xì)胞（圖1A），原代細(xì)胞以單層匯合生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，大多以類“肌細(xì)胞”樣生長(zhǎng)（圖1B），隨著傳代次數(shù)的增加會(huì)形成兩種不同細(xì)胞群，即開(kāi)放型和閉合型細(xì)胞群開(kāi)放型細(xì)胞群，邊界不清，大多以類“肌細(xì)胞”樣生長(zhǎng)；閉合型細(xì)胞群，細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞以典型的“鋪路石”樣聚集生長(zhǎng)（圖1C）。隨著傳代次數(shù)的增加，乳腺細(xì)胞會(huì)形成空泡狀結(jié)構(gòu)（圖1D箭頭所示）；采用R5組培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)到18代以后，明顯衰老，細(xì)胞體積變大、呈平鋪狀、折光性差（圖1E）通常乳腺細(xì)胞形成單克隆的效率較低，但是優(yōu)化培養(yǎng)條件后原代分離培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞單隆生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖1F箭頭所示）。

2.3優(yōu)化后乳腺上皮細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果

常規(guī)配方的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞15代大量死亡，細(xì)胞呈平鋪狀，無(wú)法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。采用優(yōu)化條件下培養(yǎng)的第15代乳腺上皮細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)角蛋白CK18在牛乳腺上皮細(xì)胞的胞漿中能夠穩(wěn)定表達(dá)（圖2）。

2.4pEGFP-Cl轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率鑒定

乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)直接決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，選取上述結(jié)果中細(xì)胞體外增殖活力較好且存活時(shí)間較長(zhǎng)的R5和R7組為研究對(duì)象，結(jié)果表明：采用R5組培養(yǎng)條件下獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較R7組高（圖3）。

3討論

3.1 乳腺細(xì)胞體外培養(yǎng)條件優(yōu)化

乳腺細(xì)胞能否在體外維持穩(wěn)定生長(zhǎng)是轉(zhuǎn)基因及陽(yáng)性克隆篩選的的關(guān)鍵，目前，已經(jīng)證實(shí)一些促細(xì)胞分裂劑會(huì)促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖：如EGF、胰島素、bFGF、HGFJGF-I.TGF-β、胎牛血清、乳腺提取物等都可以刺激乳腺上皮細(xì)胞的增殖'胰島素是細(xì)胞周期的主要外源性調(diào)節(jié)因子，它和胰島素樣生長(zhǎng)因子、EGF等一樣，能促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[5]。：EGF和bFGF有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂活性和促生長(zhǎng)作用[6、7].

本研究通過(guò)群體倍增時(shí)間和不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的傳代次數(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)液對(duì)hMGEs體外生命的維持[8]。結(jié)果表明1：1DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子+10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰島素+0.1mmol/L非必須氨基酸是維持乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的最適條件。利用此條件培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)良好，活力旺盛，能夠維持20代左右的生長(zhǎng)活力。此外，我們發(fā)現(xiàn)EGF與bFGK混合添加不僅促進(jìn)乳腺匕皮細(xì)胞的增殖還能延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。

3.2優(yōu)化條件下培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞特征分析細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的好壞直接決定了體外研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。因此，本研究在優(yōu)化了乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)了此條件下培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞生物學(xué)的穩(wěn)定性、蛋白表達(dá)情況及轉(zhuǎn)基因的效率。通常培養(yǎng)條件下，組織塊遷移的時(shí)間大約需要10?14d，采用優(yōu)化條件后獲得乳腺上皮細(xì)胞時(shí)間7～10d，縮短了周期，優(yōu)化后的乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛，細(xì)胞生物學(xué)特征穩(wěn)定，且單克隆形成的效率較高。常規(guī)配方的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞15代大量死亡，細(xì)胞呈平鋪狀，無(wú)法檢測(cè)蛋n表達(dá)情況但是采用優(yōu)化條件下培養(yǎng)的第15代乳腺上皮細(xì)胞仍能穩(wěn)定表達(dá)上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋hCK18進(jìn)一步驗(yàn)證其轉(zhuǎn)基因的效率高低，結(jié)果表明采用體外培養(yǎng)條件下優(yōu)化后獲得的乳腺上皮細(xì)胞第10代做基因轉(zhuǎn)導(dǎo)具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]MCFFDDEN J W， CORL B A. Activation of AMP —activated protein kinase （AMPK） inhibit fatty acid synthesis in bovine mammary epithelial cells|J]. Biochemical and Biophysical Re?search Coniniunications， 2009. 390（3）： 388—393.

[2]HARICHARAN S， LI Y. ST AT signaling in mammary gland differentiation， c-ell survival and tumorigenesis[Jl. Molecular and Cellular Endocrinology， 2014， 382（1）：560-569

[3]閆晶，賀小英，潘春留，等。pEGFP-hTERT真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染牛乳腺細(xì)胞的優(yōu)化方案[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展（YAN Jing， HE Xiao-ying， PAN Chun-liu， et al. Construction of eu- kaiyolic expression vector pEGFP—hTERT and the optimaization of scheme on Bovine mammary cell transfection [J]. Progress in Veterinary Medicine）， 2009， 30（5）： 14-19.

[4]李慶章.乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)[M|.北京：科學(xué)出版社（LI Qing—zhang. Development and Lactation Biology of Mammary GlandfM]. Beijing： Science Press）， 2009. 103.

[5]DARLINGD C， MORGANS J. Animal cells： Culture and Media[M]. New York：John Wiley and Sons， 1994.

[6]CORENTIN C M， LYNDA E， PAUL C， et al. Epidermal growth factor increases undifferentiated pancreatic- embryonic cells in vitro. A balance between proliferation and differentiation[J|. Dia?betes， 2001， 50： 1571-1579.

[7] SUAREZ-PINZON W L， LAKEY J K， BRAND S J， et al. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human Islet （3 -Cells from pancreatic duct cells and an increase in functional ）3—f：ell massfj）. The Jour?nal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2005， 90 （6）： 3401-3409.

[8]李攝，張君，潘軒，等.體外培養(yǎng)條件下不同氧濃度對(duì)幾種細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)（U Jing， ZHANG Jun， PAN Xuan， et al. Effects of different oxygen concentrations on growth of several kinds of cells in vitro[J]. Journal of Natural Science of Hunan Normal University） ，2014， 37（6）： 13-18.