王建美 ，宋煥春 ，陳 菲

（1.金華職業(yè)技術(shù)學院，浙江 金華 321007； 2.浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000）

桔皮是蕓香科植物柑橘屬桔類和柑類的成熟果皮。我國是世界上柑橘種植面積和產(chǎn)量最大的國家，主要種植地為浙江、福建、湖南等地區(qū)，其中浙江衢州被農(nóng)業(yè)部命名為“中國 柑之鄉(xiāng)”，柑栽培歷史有1 400多年[1]。桔皮產(chǎn)量約占柑橘產(chǎn)量的20%～40%，但其在柑橘加工生產(chǎn)時常被當作廢棄物處理。桔皮中含有1% ～3%的精油[2－3]，是食品、日化用品和香水等的優(yōu)質(zhì)原料[4－5]，提取桔皮精油可使柑橘類產(chǎn)品得到進一步的利用，提高其附加值[6]。目前，桔皮精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、纖維素酶解法、萃取法、超聲波提取法、壓榨法等，各有優(yōu)劣。復(fù)合酶法輔助提取桔皮精油的工藝未見文獻報道。果膠酶是使細胞間的果膠質(zhì)降解，轉(zhuǎn)化為可溶性的果膠，從而把細胞從組織內(nèi)分離出來；纖維素酶是通過破壞細胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，極大地減少傳質(zhì)屏障對有效成分擴散的阻礙，增加活性成分從植物細胞內(nèi)溶出，從而提高得率[6－7]。由于單因素考察不能反映各因素間的相互作用，本研究中以正交設(shè)計－重復(fù)試驗的方法對相關(guān)工藝參數(shù)進行優(yōu)選，采用復(fù)合酶法輔助水蒸氣蒸餾法的提取工藝，以桔皮精油的得率為考察指標，為復(fù)合酶－水蒸氣蒸餾法提取桔皮精油的規(guī)模化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用提供理論支持。

1 儀器與試藥

HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；101型電熱恒溫干燥箱（中國龍口市先科儀器公司）；GX－8型高效粉碎機（江陰市駿朗機械設(shè)備有限公司）；恒溫水浴鍋（杭州藍天化驗儀器廠）；SB30001型電子天平（上表電子儀器廠）。浙江省衢州市產(chǎn)柑橘（經(jīng)浙江省金華職業(yè)技術(shù)學院施淑琴中藥師鑒定為Citrus reticulata Blanco cv.Reticulata)剝離得到的桔皮；纖維素酶（10 萬 U /mL）、果膠酶（3 萬 U /mL）均購于柏漢森（山東）生物科技有限公司；無水乙醚、氯化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝考察

預(yù)處理：將新鮮桔皮在40℃用恒溫干燥箱烘干，干桔皮用高效粉碎機粉碎，過30目篩[8]備用。

提取工藝：水蒸氣蒸餾法[9－10]并輔以復(fù)合酶酶解提取桔皮精油。準確稱取25 g已預(yù)處理的碎桔皮，放入圓底燒瓶中，加復(fù)合酶（纖維素酶和果膠酶）適量，再加蒸餾水50 mL，攪勻，調(diào)節(jié)pH，設(shè)定溫度后，在恒溫水浴鍋中酶解一定時間，裝上水蒸氣蒸餾裝置，蒸餾，收集餾分，向其中加入適量30 g/L的氯化鈉，靜置，過濾，濾液用無水乙醚萃取2次，然后向萃取液中加適量無水硫酸鈉，放置過夜，回收乙醚即得桔皮精油產(chǎn)品，稱重。每項試驗平行操作3次。

考察指標：桔皮中精油得率，計算公式為，精油得率(%)＝[最后得到的精油量（g） /桔皮的原料量（g）]× 100% 。

2.2 正交試驗優(yōu)選

根據(jù)桔皮精油的性質(zhì)、實際操作要求和單因素試驗結(jié)果，擬訂影響桔皮精油得率的4個主要因素，即因素A（果膠酶與纖維素酶配比）、因素 B（酶解溫度）、因素C（蒸餾時間）和因素 D（pH）作為優(yōu)選因素，進行 L9（34）正交試驗。因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。采用SPSS 19.0軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較行 t檢驗。P＜0.05為具有顯著性差異。方差分析結(jié)果見表3。由表2可見，極差 R值大小顯示，不同因素對桔皮中精油得率的影響程度為 D＞C＞B＞A；由表3可見，因素 B，C，D的影響具有顯著性意義，A因素的影響無顯著性意義。由表2和表3可知，4個因素的最優(yōu)組合為A2B1C3D2，即用果膠酶與纖維素酶配比（U /U）1∶2，pH 為 4，50℃下酶解，然后蒸餾 3 h的精油得率最高。其中酶解溫度50℃與研究[6]中酶解溫度對桔皮中精油得率的影響相一致。

表1 正交試驗設(shè)計 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果方差分析

2.3 驗證試驗

對正交試驗篩選得到的最優(yōu)提取工藝A2B1C3D2，與正交設(shè)計中的最優(yōu)方案A3B1C3D2進行比較，同時考慮正交試驗顯示因素A對桔皮精油得率影響程度最小，為了驗證復(fù)合酶對提取是否有促進作用，采用不加酶、最佳條件A3B1C3D2與最優(yōu)提取工藝A2B1C3D2進行對比驗證。結(jié)果見表4?？梢?，A2B1C3D2與A3B1C3D2間無明顯差別；而是否加酶對桔皮中精油的得率有顯著性影響，加復(fù)合酶使桔皮精油得率增加了28.99%。綜合以上因素，A2B1C3D2提取工藝條件理想，結(jié)果穩(wěn)定、合理。

表4 最優(yōu)工藝驗證試驗結(jié)果及比較

3 討論

復(fù)合酶酶解輔助水蒸氣蒸餾的方法提取桔皮中的精油與單一水蒸氣蒸餾法相比得率高。其原因可能是桔皮中不僅有大量纖維素，也存在一些果膠成分，故纖維素酶與果膠酶聯(lián)合使用效果好。

由預(yù)試驗確定因素及其水平范圍，進行復(fù)合酶酶解輔助水蒸氣蒸餾法提取桔皮中精油的正交試驗，為減少方法誤差和操作誤差等對試驗結(jié)果的影響，采用正交設(shè)計－重復(fù)試驗以優(yōu)化提取工藝，獲得最優(yōu)條件是：果膠酶與纖維素酶配比為1∶2，pH＝4，50℃，蒸餾時間 3 h。采用此工藝條件，桔皮中精油的得率是2.18%，其中各因素的影響順序是D＞C＞B＞A。

由表2可知，正交試驗表 L9(34)各列均被因素排滿，且沒有誤差列，也無相關(guān)信息提供經(jīng)驗誤差。為了避免增加試驗次數(shù)和使用更大的正交表，故采用重復(fù)試驗的方法來估算試驗誤差，進行正交試驗的方差分析。1

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