李宏謙，常永超，姜雅琳，陳夢(mèng)露，李小珍，高 強(qiáng)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌組織中表達(dá)的探討

李宏謙，常永超，姜雅琳，陳夢(mèng)露，李小珍，高 強(qiáng)

目的 探討NADPH氧化酶NOX2和NOX3基因在胃癌組織中的表達(dá)情況。方法 收集在我院行胃癌根治術(shù)患者的胃癌及自身正常對(duì)照組織標(biāo)本各15例，慢性胃炎患者胃鏡下活檢胃黏膜組織標(biāo)本20例，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)NOX2和NOX3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果NOX2和NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于自身正常對(duì)照組織和慢性胃炎組織；NOX2 mRNA在胃癌自身正常對(duì)照組織與慢性胃炎胃黏膜組織中的表達(dá)無明顯差異；NOX3 mRNA在后兩者中的表達(dá)量均很少。結(jié)論 NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

NADPH氧化酶；NOX2；NOX3；胃癌；慢性胃炎

胃癌在我國是一種常見的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多因素和多環(huán)節(jié)。流行病學(xué)調(diào)查和病因?qū)W顯示胃癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、幽門螺桿菌感染等諸多因素綜合作用有關(guān)。NADPH氧化酶家族由NOX1-5、DUOX1和DUOX2組成，這組氧化酶可以產(chǎn)生活性氧類 (Reactive oxygen species, ROS)[1-2]。ROS是一類氧衍生的分子，包括超氧化物、過氧化氫、羥自由基及各種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，ROS可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常行為，也能夠影響細(xì)胞的有絲分裂或表型轉(zhuǎn)換，還可以誘導(dǎo)血管源性因子如血管內(nèi)皮生長因子的分泌，最終促進(jìn)腫瘤新生血管形成和腫瘤細(xì)胞增殖[3]。有研究表明，NOX可能與細(xì)胞分化相關(guān)，Geiszt等[4]發(fā)現(xiàn)在大腸癌細(xì)胞被誘導(dǎo)分化過程中NOX1表達(dá)顯著升高。NOX的異常表達(dá)和激活可以引起正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化或凋亡壞死[5]。此外，NOX還影響某些基因的表達(dá)，在NOX1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂或腫瘤源性相關(guān)的基因、細(xì)胞周期相關(guān)的基因、信號(hào)傳遞蛋白基因、與人類腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)生成或激活的蛋白基因等多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[6]。本文通過研究胃癌組織中NOX2和NOX3基因的表達(dá)情況，探討NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2013年8月至2014年2月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的行胃癌根治術(shù)的患者15例(男9例，女6例)，年齡40～65歲，平均53歲，以及同期有消化道癥狀來我院做胃鏡檢查的慢性胃炎患者20例(男10例，女10例)，年齡35～60歲，平均48歲。

1.2 標(biāo)本收集 手術(shù)室取切除的胃癌組織標(biāo)本與距病變組織5 cm以外的正常對(duì)照組織各1塊，預(yù)冷的PBS清洗后立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫溆啻篌w標(biāo)本送病理檢查。胃鏡下取黏膜組織2塊，部位為胃竇部距幽門口2～3 cm處，其中1塊立即存放于液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，?塊送組織病理學(xué)檢查。

1.3 NOX2和NOX3基因表達(dá)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量(Real time, RT) PCR檢測(cè)NOX2和NOX3 mRNA表達(dá)：取200 mg組織，放到無RNase的1.5 mL離心管中，采用Trizol(美國Invitrogene公司)法提取總RNA，用核酸定量儀測(cè)定RNA純度和濃度。取總RNA 2 μg, 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。冰上配制PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Taq II (2×) 12.5 μL, DEPC水8.5 μL, 上下游引物(表1)各1 μL。在BIO-RAD RT PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃ 變性5 s、57 ℃(NOX2)/ 58℃(NOX3)退火30 s、72℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以閾循環(huán) (Ct) 值表示，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值，β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

NOX2 mRNA 在胃癌組織中的表達(dá)明顯增加(4.6±1.6)分別是正常對(duì)照組織的3.1倍(P=0.03)和慢性胃炎組織的2.5倍(P=0.01)，NOX2 mRNA在慢性胃炎與胃癌自身正常對(duì)照組織的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。與NOX2 mRNA 表達(dá)情況相同，NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯增加 (10.0±1.9)，是胃癌自身正常對(duì)照組織和慢性胃炎胃黏膜組織的2.7倍(P<0.05)，后兩者均少量表達(dá)且兩組之間無差別。見表2。

組別nNOX2NOX3胃癌組154．6±1．610．0±1．9胃癌自身正常對(duì)照組156．2±2．311．4±1．8慢性胃炎組205．9±1．111．5±2．2

注：各組mRNA的Ct值均為減去內(nèi)參β-Actin Ct值所得的ΔCt值

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法對(duì)胃癌與自身正常對(duì)照組織及慢性胃炎組織標(biāo)本中NOX2和NOX3 mRNA 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示NOX2和NOX3 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于自身正常對(duì)照以及慢性胃炎組織，提示NOX2和NOX3在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

NOX2基因位于X染色體p21.1，編碼含有570個(gè)氨基酸的NOX2蛋白。NOX2首先在中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜均有NOX2表達(dá)，靜息狀態(tài)時(shí)NOX2定位在細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)生ROS，當(dāng)受到病原微生物和細(xì)胞因子等外界刺激時(shí)，NOX2會(huì)易位到細(xì)胞的表面并被迅速激活。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NOX2。人類NOX3與NOX2氨基酸序列有56%的同源性[7]，NOX3在內(nèi)耳高表達(dá)，在胎兒的脾、腎、顱骨和腦也有表達(dá)。在有調(diào)節(jié)亞基p47phox等存在的情況下能夠明顯增加NOX3的活性。正常情況下，NOX家族氧化酶產(chǎn)生的ROS能維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，但當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境中的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和生長因子等刺激時(shí)[8]，就會(huì)引發(fā)NOX家族氧化酶過表達(dá)產(chǎn)生大量ROS，產(chǎn)生的大量ROS可與大多數(shù)細(xì)胞大分子發(fā)生反應(yīng)，可使酶失活，引起DNA損傷，DNA異常甲基化等，從而誘發(fā)癌基因激活、抑癌基因失活、修飾翻譯后的蛋白質(zhì)及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜，機(jī)體多種疾病的發(fā)生都與此密切相關(guān)[7,9]。

胃癌的發(fā)生常伴有多種基因的異常表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)研究顯示NOX2和NOX3基因在胃癌組織中高表達(dá)，表明NOX2和NOX3可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，過量表達(dá)的NOX2產(chǎn)生過多的ROS導(dǎo)致了DNA異常修飾從而引起DNA損傷，同時(shí)導(dǎo)致癌基因的激活和抑癌基因的失活，在胃癌的發(fā)展階段，過量表達(dá)的ROS通過對(duì)MAPKs、JAK-STAT、NF-КB等[10-12]信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤血管的生成和細(xì)胞凋亡的抑制等。另一方面NOX2和NOX3產(chǎn)生的ROS可能增加細(xì)胞的遷移速率從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[13-14]。這一系列的過程最終影響了胃癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中NOX3在慢性胃炎胃黏膜和胃癌自身正常對(duì)照組織中的表達(dá)量均很少，而在胃癌組織中的表達(dá)量大量增加，提示在胃癌的發(fā)展過程中NOX3發(fā)揮了重要作用?？傊赴┑陌l(fā)生發(fā)展涉及多環(huán)節(jié)多階段，作者通過對(duì)NADPH氧化酶NOX2和NOX3在胃癌中表達(dá)情況的探討，使得對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有了一些更多的思考，但還有許多細(xì)胞方面的機(jī)理未完全闡明，諸如NADPH氧化酶與腫瘤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系等。NADPH氧化酶在疾病發(fā)生中的作用已得到目前眾多學(xué)者的關(guān)注和研究，新的NOX蛋白家族特異性靶點(diǎn)的闡明，可能為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展和腫瘤的臨床治療提供新的思路。

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Expression of NADPH OxidaseNOX2 andNOX3 mRNAin Human Gastric Cancer

LI Hong-qian, CHANG Yong-chao, JIANG Ya-lin,et al

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003, China)

ObjectiveTo investigate the expression of NADPH oxidaseNOX2 andNOX3 mRNA in human gastric cancer tissues.MethodsFifteen samples from radical resection of gastric cancer, 15 samples from normal control group, and 20 biopsies from chronic gastritis patients were collected from the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology.NOX2 andNOX3 mRNAs were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression ofNOX2 andNOX3 mRNAs were significantly increased in the gastric cancer compared to non-cancerous tissues and specimens of chronic gastritis. There was no significant difference inNOX2 mRNA expression between tumor-matched normal mucosa and tissue of chronic gastritis, and the expression ofNOX3 mRNA was also very low.ConclusionNADPH oxidase ofNOX2 andNOX3 may play an important role in the process of the occurrence and development of gastric cancer.

NADPH oxidase；NOX2；NOX3；gastric cancer；chronic gastritis

國家自然科學(xué)基金(No.81370487)

2015-01-11

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471003

李宏謙(1982-)，男，河南清豐人，碩士研究生在讀，從事消化系統(tǒng)疾病的臨床檢驗(yàn)和診斷學(xué)研究。

高強(qiáng)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：gaoq37@yeah.net

R573.9

A

1672-688X(2015)01-0001-03