王健楊軍平

SORL1基因表達(dá)及其rs2282649位點(diǎn)多態(tài)性與遲發(fā)性阿爾茨海默病相關(guān)性研究*

王?、贄钴娖舰?/p>

目的：分析江西地區(qū)漢族人群分揀蛋白相關(guān)受體1（SORLl）及其rs2282649位點(diǎn)多態(tài)性與遲發(fā)性阿爾茨海默?。↙OAD）是否存在關(guān)聯(lián)。方法：采用病例對照研究，提取所有研究對象的外周血中基因組DNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增DNA，送至深圳華大基因應(yīng)用單堿基多位點(diǎn)微測序法（snaPshot）檢測SORLI基因和rs2282649位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的表達(dá)分布情況。結(jié)果：LOAD組和對照組的基因型頻率、等位基因的分布具有群體代表性（P>0.05）。LOAD組中TT、TC和CC基因型分別為80例（59.3%）、35例（25.9%）和20例（14.8%），對照組分別為64例（34.2%）、75例（40.1%）和48例（25.7%），兩組的SORLl基因rs2282649單核苷酸多態(tài)性基因型分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ 字2=11.254，P=0.007），兩組的C等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ 字2=5.402，P=0.019，OR=1.528，95%CI=0.872～2.116）。結(jié)論：SORL1基因與江西地區(qū)漢族人群LOAD的發(fā)生相關(guān)，其中rs2282649位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性占據(jù)重要作用，C等位基因?yàn)槲ｋU等位基因。

阿爾茨海默??；SORLl基因；單核苷酸多態(tài)性

阿爾茨海默病是老年癡呆最重要的病因，給患者及社會都帶來沉重的負(fù)擔(dān)，其中又以遲發(fā)性阿爾茨海默病更為多見[1]。分子遺傳學(xué)研究表明遺傳異質(zhì)性是AD的發(fā)生的重要危險因素。繼Strittmatter等[2]于1993年首次發(fā)現(xiàn)APOE基因84等位基因是LOAD（Late-onset type of alzheimer's disease）的主要風(fēng)險因素之后，SORLl（Sortilin-related Receptor 1）成為第二個AD發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險因素，并成為AD的研究熱點(diǎn)[3]。目前研究主要關(guān)于北歐人，西班牙人，非洲的美國人和以色列的阿拉伯人，關(guān)于亞洲或者我國人群的研究甚少。高欣等[4]研究發(fā)現(xiàn)SORLI基因rs2070045位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與北京地區(qū)漢族人群遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙（aMCI，Amnestic Mild Cognitive Impairment）的發(fā)生明顯相關(guān)，G等位基因?yàn)槲ｋU等位基因。但是SORLl基因rs2282649位點(diǎn)多態(tài)性在中國漢族AD人群中尚無報道，本研究通過對LOAD患者SORLl基因rs2282649位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測，探討該位點(diǎn)多態(tài)性與LOAD的相關(guān)性和風(fēng)險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2015年6月在江西地區(qū)經(jīng)篩查得到LOAD患者135例作為LOAD組，男58例，女77例，平均年齡（76.2±5.3）歲；體檢正常者187例作為對照組，男84例，女103例，平均年齡（72.7±6.9）歲。對照組與LOAD組性別、文化程度、生活背景等相互匹配，并確定為無血緣關(guān)系的健康者，兩組的一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：LOAD組入選患者均符合美國AD和相關(guān)疾病協(xié)會（NINCDS-ADRDA）臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確定為“可能AD”的標(biāo)準(zhǔn)；美國精神病學(xué)會診斷和統(tǒng)計手冊癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)第四版（DSM-Ⅳ-R）輕、中度癡呆標(biāo)準(zhǔn)。簡易精神狀態(tài)檢查表（MMSE，Mini-mentalstate Examination） 評 分 9～23分， 平 均（15.1±1.98）分；臨床癡呆評定量表（CDR，Clinical Dementia Rating）評分為l（輕度）47例或2（中度）88例；Hachinski缺血指數(shù)（HIS，Hachinski Ischaemic Scale）<4分排除血管性癡呆；由參與研究的主治醫(yī)師綜合患者病史、體征、檢查資料和量表評分作出診斷。對照組均符合無記憶減退主訴，無嚴(yán)重軀體器質(zhì)性疾病，配合研究；MMSE總分≥26分；CDR=0。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：血管性癡呆、帕金森氏性癡呆及腦器質(zhì)性疾病所致的各種老年癡呆患者；正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者；頭部外傷史、特殊藥物服用史等；拒絕簽署受檢者知情同意書者。

1.3 方法

1.3.1 基本資料采集 研究對象行血、尿常規(guī)、血糖、血脂、腎功能檢查，必要時行腦卒中超聲篩查、心臟超聲檢查，所有患者行頭顱CT平掃。

1.3.2 基因組DNA提取 清晨取空腹靜脈血5 mL，血樣加EDTA抗凝劑后保存于-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。受過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員采用“酚-氯仿法”進(jìn)行基因組提取[5-6]。將血凝塊樣本解凍后，攪碎至無明顯大塊血凝塊，加生理鹽水至10 mL，充分混勻，3000 rpm離心10 min，棄掉上清。沉淀中加入2 mL CTAB，搗碎沉淀，血凝塊碎片小于上一步驟，加水至10 mL，充分混勻，3000 rpm離心10 min，棄上清，重復(fù)進(jìn)行一次。沉淀中加入少量生理鹽水，攪碎沉淀，加生理鹽水至10 mL，3000 rpm離心10 min，棄上清并晾干沉淀，加入0.5 mL×MLB溶液，37 ℃水浴過夜消化。轉(zhuǎn)移液體到EP管，加入0.5 mL酚25：氯仿24：異戊醇1混合液混勻，3000 rpm離心10 min，吸取上清液到新的EP管。加入0.5 mL氯仿混勻，3000 rpm離心10 min，吸取上清液到新的EP管，重復(fù)該步驟。在上清中加入1.0 mL提前-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻可見絮狀物質(zhì)析出，4 ℃ 12 000 rpm離心20 min，小心棄去上清。用1 mL -20 ℃預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀兩次，離心10 min 13 000 rpm/次，小心棄去上清。室溫干燥，加入70 μL TE緩沖液，充分溶解后-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR基因擴(kuò)增和分析 SORLl基因表達(dá)檢測和rs2282649位點(diǎn)基因多態(tài)性分析方法按參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，檢測達(dá)標(biāo)后送深圳華大基因應(yīng)用單堿基多位點(diǎn)微測序法（snaPshot）檢測SORLI基因和rs2282649位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的表達(dá)分布情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用（±s）表示，計數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性，用比數(shù)比（OR）值及其95%可信區(qū)間（95%CI）來評價相對風(fēng)險。

2 結(jié)果

以Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)LOAD組和對照組的基因型頻率，等位基因的分布具有群體代表性（P>0.05）。rs2282649單核苷酸多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布見表1，兩組的3種基因型頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007），兩組的兩種等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019）。SNP24基因型兩組間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），SNP24基因型C等位基因頻率與AD患病相關(guān)（0R=1.528，95%CI為0.872～2.116，P<0.05）。

表1 兩組的SORL1基因SNP24基因型和等位基因頻率的分布

3 討論

阿爾茨海默病分為早發(fā)性AD（EOAD，Earlyonset AD）和遲發(fā)性AD（LOAD），LOAD又稱為散發(fā)性AD，是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的多基因病[7]。LOAD的易患基因—載脂蛋白E（ApoE）20年來是唯一被公認(rèn)的，隨著科技的發(fā)展，逐漸被打破，新的基因組被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)：染色體2q11.3區(qū)域的橋連整合蛋白1基因（Bridging Integrator protein-1，BIN1）、染色體8p21-p12區(qū)域的簇連蛋白基因（CLU，Clusterin）、染色體1q32.1區(qū)域的補(bǔ)體受體1基因（CRI，Complement Receptor1）、染色體11q14.2區(qū)域的磷脂酰肌醇結(jié)合網(wǎng)格蛋白裝配蛋白基因（PICLM，Phosphatidylinositol-binding clathrin assemblly）、 染 色體（1lq23.2-q24.2）區(qū)域的分揀蛋白相關(guān)受體1基因（SORLl）等，其中SORL1被認(rèn)為是既ApoE之后的第二易患基因[3，8-12]。因此對于SORL1的進(jìn)一步研究可了解LOAD的發(fā)病機(jī)制，為AD的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供證據(jù)。

國內(nèi)外對于SORL1已經(jīng)進(jìn)行了諸多研究，但是對于SORLl區(qū)域上rs2282649位點(diǎn)的研究較少，尤其是對國內(nèi)人群的研究鮮有報道[13]。國內(nèi)學(xué)者研究了SORLl基因5’端的SNP 8（rs668387）和3’端的SNPl9（rs2070045）、SNP23（rs3824968）和SNP24（rs2282649）共4個位點(diǎn)進(jìn)行了研究，除了rs2070045位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙（aMCI，amnestic Mild Cognitive Impairment）人群和正常對照人群中有顯著差異外，其余3個位點(diǎn)未見差異[4]。MCI是正常老年人向老年癡呆的過渡階段，相當(dāng)一部分aMCI患者會加重為AD，這在一定程度上說明rs2282649與LOAD之間的關(guān)聯(lián)性不明確。然而，Lee等[14]在美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院（Wu）提供的病例組中對SORL1基因的10個獨(dú)立的單核苷酸位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，SNP24即rs2282649位點(diǎn)與AD患病率之間具有關(guān)聯(lián)，其中“TT”“TC”和“CC”基因型在WU病例組中分別為35、146和160例，而在對照組中為26、128和191例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。并且Ning等[15]也發(fā)現(xiàn)rs2282649等位基因頻率在漢族人群中晚發(fā)型AD與正常對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中通過對江西地區(qū)漢族人群SORL1基因和其rs2282649位點(diǎn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，江西地區(qū)漢族人群中SORL1基因和其rs2282649位點(diǎn)與LOAD具有相關(guān)性，等位基因C的頻率在LOAD組和對照組中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示等位基因C是獨(dú)立風(fēng)險等位基因。由于SNP24位于SORLl基因的內(nèi)含子區(qū)域，不進(jìn)行基因表達(dá)，因此這個多態(tài)性位點(diǎn)很可能并不影響靶基因的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)，但可能通過連鎖不平衡作用影響編碼蛋白質(zhì)的功能或通過調(diào)控信使RNA間接影響基因表達(dá)水平，這表明進(jìn)一步研究SORL1基因和其rs2282649位點(diǎn)對AD的發(fā)病機(jī)制是有必要的。

綜上所述，SORL1基因與江西地區(qū)漢族人群LOAD的發(fā)生相關(guān)，其中rs2282649位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性占據(jù)重要作用，C等位基因?yàn)槲ｋU等位基因。并且本研究基因分型方法不同和研究對象（江西漢族人群）的局限性也可能是造成結(jié)果差異性的原因。因此對于SORL1基因和其rs2282649位點(diǎn)與LOAD之間的相關(guān)性及明確機(jī)制分析還需要國內(nèi)多中心、大樣本的聯(lián)合研究。

[1]徐小惠，張志珺.脂質(zhì)代謝通路候選基因與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華腦血管病雜志：電子版，2012，6（2）：41-45.

[2] Strittmatter W J，Saunders A M，Schmechel D.Apolipoprotein E：high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1993，90（5）：1977-1981.

[3] Rogaeva E， Meng Y A ，Lee J H ，et al.The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease[J]. Nature Genetics，2007，39（2）：168-177.

[4]高欣，于會艷，孫亮，等.SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性與遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)聯(lián)分析[J].卒中與神經(jīng)疾病，2013，20（2）：71-76.

[5]王曉英，余晨曦.外周血單個核細(xì)胞DNA提取方法的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2014，22（5）：1495-1498.

[6]宋潔云，劉芳宏，馬軍，等.酚/氯仿法和鹽析法提取人類外周血基因組DNA方法的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（5）：802-805.

[7]盧曉雄，呂清，浦佳麗，等.阿爾茨海默病患者早老素-1基因突變檢測及其突變后對早老素-1和淀粉樣前體蛋白表達(dá)功能的影響[J].中華神經(jīng)科雜志，2013，46（1）：5-9.

[8] Kamboh M I， Demirci F Y，Wang X，et al.Genome-wide association study of Alzheimer's disease[J].Translational Psychiatry，2012，15（2）：1316-1327.

[9] Wang J，Yu J T，Tan M S，et al.Epigenetic mechanisms in Alzheimer's disease：implications for pathogenesis and therapy[J]. Ageing Research Reviews，2013，12（4）：1024-1041.

[10] Reitz C，Jun G，Naj A，et al.Variants in the ATP-binding cassette transporter （ABCA7）， apolipoprotein E?4，and the risk of lateonset Alzheimer disease in African Americans[J].Jama the Journal of the American Medical Association，2013，309（14）：1483-1492.

[11] Killick R，Hughes T R，Morgan B P，et al.Deletion of Crry， the murine ortholog of the sporadic Alzheimer’s disease risk gene CR1，impacts tau phosphorylation and brain CFH[J].Neuroscience Letters，2013，15（533）：96-99.

[12] Yu J T，Song J H， Ma T，et al.Genetic association of PICALM polymorphisms with Alzheimer’s disease in Han Chinese[J].Journal of the Neurological Sciences，2011，300（1-2）：78-80.

[13]薛曉帆，許二赫.SORL1基因與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2012，32（18）：4100-4102.

[14] Lee J H，Barral S，Reitz C.The neuronal sortilin-related receptor gene SORL1 and late-onset Alzheimer’s disease[J].Curr Neurol Neurosci Rep，2008，8（5）：384-391.

[15] Ning M，Yang Y F，Zhang Z，et al. Amyloid-β-related genes SORL1 and ACE are genetically associated with risk for late-onset Alzheimer disease in the Chinese population[J].Alzheimer Disease & Associated Disorders，2010，24（4）：390-396.

A Research about SORL1 Gene Expression and rs2282649 Polymorphism Associated with Late-onset Alzheimer’s Disease

WANG Jian，YANG Jun-ping.//Medical Innovation of China，2015，12（33）：001-003

Objective：To analyze the association between SORLl and rs2282649 polymorphisms of LOAD in Jiangxi Han population.Method：A case-control study was performed and all subjects’ peripheral genomic DNA was extracted.RT-PCR was applied to amplify DNA and then the expression and distribution of SORL1 gene and rs2282649 were detected through snaPshot in BGI Shenzhen.Result：The genotype and allete of LOAD group and normal control group had group representation （P>0.05）.The genotype of TT， TC and CC of LOAD group were respectively 80 cases（59.3%），35 cases（25.9%） and 20 cases（14.8%）；and in 187 cases of the control group of those were respectively 64 cases（34.2%），75 cases（40.1%） and 48 cases（25.7%）.There was significant difference of the distribution of genotype and allele frequency between the two groups（P<0.05）.The frequencies of the allele C of two groups had significant difference（ 字2=5.402，P=0.019，OR=1.528，95%CI=0.872-2.116）.Conclusion：SORL1 gene is associated with the occurrence of LOAD in Han population of Jiangxi province and rs2282649 single nucleotide polymorphism plays an important role，C allele is the risk allele.

Alzheimer's disease；SORLl gene；Single nucleotide polymorphisms

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.33.001

2015-07-12） （本文編輯：周亞杰）

2013年度江西中醫(yī)藥大學(xué)校級課題（2013ZR006）

①江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江西 南昌 330006

王健

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Jiangxi University of TCM，Nanchang 330006，China