宋 卓，蔡小慶,閆曉東,劉思樂,王 征

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院,湖南長沙 410128)

綠原酸對高脂飼喂SD大鼠脂肪組織三酰甘油合成降解關鍵酶基因表達的影響

宋 卓，蔡小慶+,閆曉東,劉思樂,王 征*

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院,湖南長沙 410128)

目的:研究綠原酸對高脂飼喂SD大鼠附睪脂肪組織三酰甘油合成及代謝關鍵酶基因表達的影響,探討綠原酸改善肥胖的新靶點。方法:雄性SD大鼠隨機分成對照組(NC)、高脂飼料模型組(HFD)、高脂飼料+綠原酸低、高劑量組(20、90mg·kg-1·d-1,HFD-LC、HFD-HC)和羅格列酮組(ROS),飼養(yǎng)12周后處死,測定體脂含量變化以及附睪脂肪組織中二酰甘油?；D移酶(Diacylgycerol acyltransferase 2,DGAT2)、甘油三脂脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)和激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)mRNA表達水平。結果:與NC組相比,HFD組體脂含量、DGAT2、HSL mRNA表達水平明顯升高,ATGL mRNA表達水平下降不顯著。與HFD組相比,HFD-LC、HFD-HC對體脂率、DGAT2 mRNA影響不明顯(p>0.05),但能極顯著提高ATGL mRNA表達水平,HFD-HC組HSL表達水平也極顯著上升。結論:綠原酸能顯著提高大鼠附睪脂肪組織ATGL和HSL mRNA表達水平,有效控制體脂堆積。

綠原酸,脂代謝,ATGL,HSL,DGAT2

隨著社會的飛速發(fā)展,人們的飲食生活產生了巨大的改變,肥胖日益成為全球性的公共衛(wèi)生問題。據(jù)報道,到2030年,全球將有21.6億成年人體重超重,11.2億人體重達到肥胖[1-2]。由肥胖誘導產生的慢性炎癥將進一步引發(fā)胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)并促進各類代謝綜合征的發(fā)生,如2型糖尿病、心血管疾病、動脈粥樣硬化、癌癥等等[3]。肥胖的類型分為三大類:遺傳性肥胖、繼發(fā)性肥胖和單純性肥胖。前兩者是基因及機體內分泌障礙所導致,占肥胖人群比例小,后者是由營養(yǎng)過剩導致的全身性脂肪過度積累,占肥胖人群總數(shù)90%以上[4]。機體營養(yǎng)過剩時,多余的能量主要以三酰甘油的形式儲存起來,因此,對三酰甘油(Triglyceride,TG)合成及代謝關鍵酶的調控,是緩解肥胖的重要靶點之一。

表1 普通飼料營養(yǎng)成分表Table 1 Composition of the basal diet

表2 高脂飼料配方表Table 2 Composition of the high fat diet

綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是一類廣泛存在于食物中的多酚化合物,異構體及其衍生物豐富[5],以5-咖啡?？崴?5-caffeoylquinic acid ,5-CQA)在自然界中最為常見。在杜仲、金銀花、向日葵、咖啡等植物以及蘋果、蔬菜、大豆、綠茶等食品中含量較高[6]。Khang[7]等研究發(fā)現(xiàn),綠原酸可通過對AMPK的活化,影響下游乙酰輔酶A羧化酶的表達,進而降低脂肪酸合成;Zhang[8]等用db/db小鼠發(fā)現(xiàn),綠原酸干預12周后,血漿中TG濃度顯著降低;邱陽陽[9]體外研究咖啡堿、綠原酸對3T3-L1細胞分化過程中相關基因、酶表達的影響發(fā)現(xiàn),咖啡酸、綠原酸組合能抑制細胞分化前期PPARγ2的表達,增強AMPK、ATGL、HSL mRNA、蛋白的表達和酶活性,從而降低脂肪酸合成、減少TG積累。體內實驗[7]發(fā)現(xiàn)綠原酸對脂肪酸合成酶的活性顯著降低;本實驗組前期也發(fā)現(xiàn),綠原酸在抗氧化抗炎癥、調節(jié)糖脂代謝等方面都有卓著功效,能通過對PPARs的調節(jié),改善長期高脂飲食導致的脂代謝紊亂,減緩脂肪肝的形成[10-13]。但是,關于綠原酸對高脂飲食條件下,脂肪組織三酰甘油合成及代謝關鍵酶的影響還鮮有報道。因此,本實驗擬研究高脂飲食條件下,綠原酸干預對SD大鼠脂肪組織三酰甘油合成及代謝關鍵酶表達的影響,探討綠原酸改善肥胖的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠原酸(CGA) 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;羅格列酮 成都恒瑞制藥有限公司;雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠 40只,SPF級,210～230g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,合格證編號為(No.43004700000100);Trizol 美國Invirtrogen公司;反轉錄試劑盒 美國Fermentas公司;熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green) 天根生化科技有限公司。

實驗過程中所用普通飼料及高脂飼料均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司生產,普通飼料營養(yǎng)成分列于表1,高脂飼料配方見表2。經計算[14],普通飼料總能13.3兆卡/千克,其中脂肪提供16%的能量;高脂飼料脂肪總能19.5兆卡/千克,其中脂肪提供55%的能量。

1.2 實驗方法

1.2.1 處理方法 大鼠適應性飼養(yǎng)一周后,隨機分為5組:空白對照組(NC組)、模型組(HFD組)、高低劑量綠原酸干預組(HFD-HC組、HFD-LC組)以及陽性對照組(ROS組),NC組給予普通飼料喂養(yǎng),其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng),自由攝食飲水。其中HFD-LC和HFD-HC組分別按照綠原酸20mg·kg-1·d-1和90mg·kg-1·d-1劑量進行灌胃;ROS組按照羅格列酮3mg·kg-1·d-1劑量進行灌胃;NC組和HFD組則每天灌胃等體積超純水。定期測定大鼠體重,飼喂12周后處死,取大鼠腎周脂肪、附睪脂肪稱重,計算體脂率。體脂率(g/kg)=(腎周脂肪質量g+附睪脂肪質量g)/大鼠體重(kg)。取部分附睪脂肪組織于凍存管中用液氮速凍后,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR檢測附睪脂肪組織DGAT、HSL、ATGL mRNA表達 TRIZOL法提取脂肪RNA,微量光度計檢測RNA含量和純度;取1μg RNA,按試劑盒步驟反轉成cDNA(體積20μL);用Primer Premier 5.0進行引物設計;以β-actin作為管家基因,進行熒光定量PCR(20μL體系)。反應條件如下:95℃預變性15min,95℃變性10s,60℃退火20s,72℃延伸31s,延伸步驟采集熒光信號,擴增40循環(huán)后進行溶解曲線分析。引物設計如下:DGAT2 ,F:CTGCTGGTCAGGTTTTTCTTAC,R:TCAGATTGGAG AAGAGGAGTAGG。HSL,F:CGCCTTACGGAGTCT ATGC,R:ATGGCTCTGAGTTGCCCTTA。ATGL,F:GGGTGACCATCTACCTTCCA,R:CCCAGTGAGAGG TTGTTTCGT。β-actin,F:TGAGCGCAAGTACTC TGTGTGGAT,R:TAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG。

2 結果與分析

2.1 綠原酸對高脂飼喂SD大鼠體重的影響

表3顯示，飼喂12周后，各組大鼠體重都有所增加，其中HFD組差異達顯著性水平。與HFD組相比，HFD-LC組、HFD-HC組體重及其增加量均有所降低(p<0.05或0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。ROS組最終體重接近NC組，與其并未出現(xiàn)差異(p>0.05)。

表3 綠原酸和羅格列酮干預對大鼠體重的影響Table 3 Body weights in SD rat follwing 12-week treatment with CGA or ROS

注： *：與NC組相比，p<0.05。#：與HFD相比，p<0.05；##：p<0.01。

2.2 綠原酸對高脂飼喂SD大鼠體脂率的影響

圖1結果顯示,與NC組相比,其余各組體脂率顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義。與HFD組相比,HFD-LC組、HFD-HC組、ROS組體脂率分別下降23.6%(p<0.05)、31.0%(p<0.01)、20.5%(p<0.05)。

圖1 體脂含量Fig.1 The body fat contents注:*:與NC組相比,p<0.05;**:p<0.01。 #:與HFD相比,p<0.05;##:p<0.01，圖3同。

2.3 綠原酸對脂肪組織二酰甘油?；D移酶(DGAT2)表達的影響

圖2結果顯示,與NC組相比,高脂飼喂SD大鼠附睪脂肪組織中DGAT2表達量上調了80%～105%,其中HFD組和HFD-LC組達到顯著性水平(p<0.05);而與HFD組相比,HFD-LC、HFD-HC以及ROS組都有下降的趨勢,但無顯著性差異(p>0.05)。

圖2 附睪脂肪組織中DGAT2的表達Fig.2 DGAT2 gene expression in epididymis adipose tissue注：*：與NC組相比差異顯著，p<0.05。

2.4 綠原酸對脂肪甘油三酰脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)表達的影響

圖3顯示,與NC組相比,HFD組大鼠附睪脂肪組織ATGL mRNA表達量下調了42%,HFD-LC、HFD-HC和ROS組ATGL mRNA表達水平雖然也與NC組無統(tǒng)計學差異(p>0.05),但分別上調了35%、29%和44%;與HFD組相比,HFD-LC、HFD-HC和ROS組ATGL mRNA表達量都有極顯著提高(p<0.01)。同為脂肪動員關鍵酶,HSL的結果略有不同。相比于NC組,HFD組、HFD-LC組、HFD-HC組和ROS組附睪脂肪組織HSL mRNA表達量都極顯著性的上調(p<0.01),同時,HFD-HC組和ROS組睪脂HSL表達水平較HFD組分別提升了55%(p<0.01)和37%(p<0.05),HFD-LC組HSL水平與HFD組相比,雖有上升趨勢,但無顯著性差異(p>0.05)。

圖3 附睪脂肪組織中ATGL和HSL基因的表達Fig.3 ATGL and HSL gene expression in epididymis adipose tissue

3 結論與討論

肥胖者IR的形成是多因素造成的,而其主要根源卻是脂肪組織[16]。Hirashita[17]研究發(fā)現(xiàn),Zucker糖尿病肥胖大鼠手術去除內臟脂肪后,相比空白對照組,其胰島素抵抗有所緩解。JP Despres[18]也表明,人類的內臟脂肪與代謝綜合癥也有眾多關聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn),經過12周飼養(yǎng),各組大鼠體重均有增加,相比HFD組,HFD-HC組體重顯著性降低。相比NC組,高脂飼喂SD大鼠體脂率顯著升高。與HFD組相比,ROS組體脂率有所降低,說明羅格列酮可能通過調節(jié)體脂緩解機體胰島素抵抗;高低劑量綠原酸組體脂率都顯著下降,說明綠原酸也能有效改善高脂飲食大鼠脂代謝,這與Cho的結果類似[19]。

DGAT與脂代謝關系密切,其作用機制是使二酰甘油加上脂肪酸?；纬扇８视?是三酰甘油合成過程中最后一步的限速酶,其中DGAT2主要在肝臟和脂肪中高表達[20]。而HSL和ATGL作用與之相反,前者是激素敏感脂肪分解酶,受到胰高血糖素、腎上腺激素的激活和胰島素的抑制。后者在脂解反應第一步中起主要作用,兩者占有95%的TG分解活性,是脂肪動員的關鍵酶[21-22]。本文發(fā)現(xiàn),相比NC組,高脂飼喂SD大鼠附睪脂肪組織DGAT2表達水平有明顯提高,與HFD組相比,HFD-LC組、HFD-HC組和ROS組雖有所降低,但并沒有達到顯著差異(p>0.05),說明長期攝入高脂飲食,會導致體脂率上升,引發(fā)肥胖;而綠原酸干預,對TG的合成不能產生直接影響;Oliver[23]等報道,飲食誘導的營養(yǎng)性肥胖,會導致ATGL mRNA表達量降低,本文也得出了類似結論。本研究還發(fā)現(xiàn),相比HFD組,HFD-LC、HFD-HC和ROS組附睪脂肪組織ATGL mRNA表達水平極顯著性提升,說明長期高脂飲食會影響ATGL的表達,阻礙TG的降解,造成脂質堆積,而綠原酸能改善此狀況,極顯著提高ATGL表達水平,加速TG的分解;正常情況下,HSL在體內以有活性和無活性兩種形式存在,Levin[24]等發(fā)現(xiàn)飼喂高脂飼料后,部分大鼠去甲腎上腺素含量增加,而兒茶酚胺(腎上腺素、去甲腎上腺素)又可以通過一系列作用,使無活性的HSL,轉變成有活性型,最終使HSL mRNA表達量升高。這可能是造成本研究中,高脂飼喂后,HFD組HSL表達水平極顯著高于NC組的原因。而相比于HFD組,HFD-HC組HSL mRNA表達量極顯著性上調,提升效果還略優(yōu)于ROS組(p>0.05),表明在大鼠自身上調HSL表達量的同時,高劑量綠原酸能進一步加強HSL mRNA的表達,促進三酰甘油降解。ROS組結果表明,羅格列酮干預后,大鼠HSL和ATGL mRNA的表達量上調,與文獻報導結果一致[25-26]。

關于綠原酸對大鼠機體組織中ATGL和HSL mRNA表達的調節(jié)機制,可能是其對PPARγ表達的影響。研究表明PPARγ一方面,能激活糖代謝相關基因表達,造成脂滴形成并積累[27];另一方面,能直接調控脂代謝中的關鍵酶,如脂蛋白脂肪酶基因(LPL)、小腸脂肪酸結合蛋白基因(aP2)、HSL等的表達[28]。此外,對脂肪組織的分化也起到重要作用。Brun[29]等發(fā)現(xiàn),MEFs和3T3-L1細胞敲出PPARγ基因后,其成脂分化能力喪失。而事實是否如此,還需要我們進一步探索。

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Study on the effect of chlorogenic acid on the expression of key enzyme genes involved to triglyceride synthesis and degradation in high-fat diet-fed Sprague-Dawley rat adipose tissue

SONG Zhuo,CAI Xiao-qing+,YAN Xiao-dong,LIU Si-le,WANG Zheng*

(College of Bioscience & Biotechnology,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China)

Objective:In order to explored the effect of chlorogenic acid on the expression of key enzyme genes involved to triglyceride synthesis and degradation in high-fat diet-fed SD rat adipose tissue. Methods:Male SD rats were randomly divided into 5 groups:normal control group(NC),high-fat diet group(HFD),HFD with low-dose CGA(20mg/kg;HFD-LC)group,HFD with high-dose CGA(90mg/kg;HFD-HC)group and HFD with rosiglitazone group(ROS). All mice were killed after 12 weeks and body fat mass were detected. Expression of mRNA of DGAT2,ATGL and HSL were assessed by real time PCR. Results:The body fat content,level of DGAT2,HSL mRNA of HFD rats were higher than those of NC rats,while there was no significant difference between NC and HFD rats in the expression of ATGL. The level of ATGL mRNA in HFD-LC and HFD-HC rats were higher than those of HFD rats,HSL mRNA expression in HFD-HC was significantly higher than those in HFD,but it had no significant difference between HFD and HFD-LC,HFD-HC in the expression of DGAT2 mRNA and the body fat mass. Conclusion:Chlorogenic acid enhanced ATGL and HSL mRNA expression in epididymis adipose tissue of SD rat.

chlorogenic acid;lipid metabolism;ATGL;HSL;DGAT2

2014-08-08 +并列第一作者。

宋卓(1991-),男,在讀碩士研究生,研究方向:天然產物利用及營養(yǎng)與藥理。 蔡小慶(1995-),女,本科在讀,研究方向:天然產物利用及營養(yǎng)與藥理。

*通訊作者:王征(1967-),女,博士,教授,研究方向:天然產物利用及營養(yǎng)與藥理。

國家自然科學基金(31071531);湖南省教育廳重點項目(14A071);湖南農業(yè)大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃(XCX14016)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0336-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.060