張圣方,趙龍玉,王 雪,趙鳳春,楊正友

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系,農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018)

泰山蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清蛋白含量和體內(nèi)抗氧化能力的影響

張圣方,趙龍玉,王 雪,趙鳳春,楊正友*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系,農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018)

目的:研究泰山蛹蟲(chóng)草多糖(Cordycepstaishanensispolysaccharide,CTP)對(duì)免疫抑制小鼠血清蛋白含量和抗氧化能力的影響。方法:通過(guò)對(duì)小鼠灌服多糖實(shí)驗(yàn),觀(guān)察CTP對(duì)小鼠血清總蛋白、白蛋白及球蛋白含量和抗氧化能力的影響。結(jié)果:與環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CY)模型組比較,三個(gè)CTP組的血清總蛋白、球蛋白和白蛋白含量均極顯著增高(p<0.01);三個(gè)CTP組的紅細(xì)胞SOD活性和血清CAT活性均顯著提高(p<0.01或p<0.05),紅細(xì)胞MDA含量均極顯著減少(p<0.01)。結(jié)論:CTP能顯著提高CY所致的免疫損傷小鼠的血清蛋白含量,在一定程度上CTP能減輕CY對(duì)小鼠肝臟的損害作用;CTP也能改善CY所致免疫損傷小鼠的抗氧化能力。

泰山蛹蟲(chóng)草多糖,環(huán)磷酰胺,免疫損傷小鼠,血清蛋白,體內(nèi)抗氧化

泰山蟲(chóng)草(Cordycepstaishanensis)是一種自然野生的蛹蟲(chóng)草,隸屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、麥角菌目(Clavioipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲(chóng)草屬(Cordyceps)中的子囊真菌[1]。蛹蟲(chóng)草多糖是從蛹蟲(chóng)草子實(shí)體或菌絲體中提取的具有多種生物學(xué)和免疫學(xué)活性的真菌多糖。它具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功能,近年來(lái)已引起人們的廣泛關(guān)注[2-8]。一些研究也發(fā)現(xiàn)多糖能使血清蛋白濃度升高[9]。但是泰山蛹蟲(chóng)草多糖(CTP)是否在生物體內(nèi)具有明顯的抗氧化功能,是否能夠提高血清蛋白含量并具有護(hù)肝解毒的作用,目前仍無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

肝臟是蛋白質(zhì)合成的重要器官之一,是合成血漿白蛋白的器官[10]。血清總蛋白主要來(lái)自肝臟的合成和腸道的吸收,主要包括白蛋白和球蛋白。肝臟損傷時(shí),蛋白質(zhì)合成障礙可導(dǎo)致總蛋白和白蛋白含量減少。研究發(fā)現(xiàn)注射環(huán)磷酰胺(CY)會(huì)致使小鼠總蛋白、球蛋白、白蛋白降低[11],還會(huì)對(duì)小鼠正常組織細(xì)胞造成了損傷,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氧化和抗氧化方面有很大的影響[12]。CY是目前應(yīng)用的免疫抑制劑中作用最強(qiáng)的藥物之一,研究認(rèn)為CY可廣泛作為免疫抑制模型的造型劑[13-16]。

本研究通過(guò)小鼠灌服多糖實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠血清蛋白含量,血液SOD、CAT活性和MDA含量的變化,旨在探究CTP對(duì)CY所致的免疫抑制小鼠肝臟功能恢復(fù)和體內(nèi)抗氧化能力的影響,為CTP制劑的應(yīng)用推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泰山蛹蟲(chóng)草菌(藥鄉(xiāng)-3)由山東省泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

總蛋白(TP)試劑盒、白蛋白(ALB)試劑盒 上海榮盛生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;檸檬酸鈉(分析純) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;注射用環(huán)磷酰胺(優(yōu)級(jí)純) 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;ICR清潔級(jí)昆明小鼠,雄性,體重(20±2)g,由泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);WSZ-160A型漩渦振蕩器 上海一恒科技有限公司;RXZ-300B型人工氣候箱 寧波江南儀器廠(chǎng);751G型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Amersham Biosciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備泰山蛹蟲(chóng)草多糖制劑 本實(shí)驗(yàn)室采用高效提取和純化蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖的方法[17-18]獲得的CTP(子實(shí)體多糖含量測(cè)定為5.10%)。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室栽培出的泰山蛹蟲(chóng)草子實(shí)體進(jìn)行水提醇沉提取粗多糖,然后先后經(jīng)過(guò)sevage法脫蛋白、活性炭除色素、透析除小分子雜質(zhì)和SephadexG-75柱過(guò)濾層析,最后得到CTP(苯酚-硫酸法測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.94%)。

1.2.2 動(dòng)物分組和給藥 60只昆明小鼠隨機(jī)平均分為五組:正常對(duì)照組(C組)、CY模型組和三個(gè)不同劑量的CTP組。飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食、飲水。依照表1的給藥方案每天進(jìn)行定時(shí)灌胃,每次每只小鼠灌胃相應(yīng)濃度的CTP溶液或蒸餾水,連續(xù)灌胃19d;第20d,對(duì)每只小鼠腹腔注射CY或等體積的生理鹽水。

1.2.3 血樣采集與處理 腹腔注射CY 24h后,所有小鼠摘眼球采血,每10mL血樣加1mL 2.6%的檸檬酸鈉溶液來(lái)抗血凝,分裝于Eppendorf管中,-4℃保存,待測(cè)。隨后頸椎脫臼處死小鼠。

1.2.4 小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定 小鼠頸椎脫臼處死后,摘取脾臟和胸腺,除去表面的結(jié)締組織,分析天平稱(chēng)重。在處死小鼠前要同條件稱(chēng)量每只小鼠的重量。計(jì)算免疫器官指數(shù):胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠活重(g);脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/小鼠活重(g)。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.2.5 指標(biāo)的測(cè)定 分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定,血清總蛋白(TP)測(cè)定采用雙縮脲法,血清白蛋白(ALB)測(cè)定用溴甲酚綠法,血清球蛋白(GLO)含量為血清總蛋白含量與血清白蛋白含量的差值;SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑比色法,MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法,CAT活性測(cè)定采用鉬酸銨比色法。用紫外分光光度計(jì)測(cè)得對(duì)應(yīng)OD值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

實(shí)驗(yàn)小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)見(jiàn)表2,對(duì)于胸腺指數(shù),與C組相比,CY模型組和低劑量CTP組小鼠胸腺指數(shù)極顯著降低(p<0.01),中劑量和高劑量CTP組小鼠胸腺指數(shù)與C組差異均不顯著(p>0.05);與CY模型組相比較,中、高劑量CTP組小鼠胸腺指數(shù)顯著增加(p<0.05或p<0.01)。

對(duì)于脾臟指數(shù),與C組相比較,CY模型組小鼠脾臟指數(shù)極顯著降低(p<0.01),高劑量CTP組小鼠脾臟指數(shù)顯著提高(p<0.05),低、中劑量CTP組小鼠脾臟指數(shù)與C組差異均不顯著(p>0.05);與CY模型組對(duì)比,三個(gè)不同劑量的CTP組小鼠脾臟指數(shù)均極顯著提高(p<0.01)。

Table 2 The effect of thymus and

組別胸腺指數(shù)(mg/g)脾臟指數(shù)(mg/g)C組4.040±0.059##3.170±0.055##CY模型組3.084±0.355**2.154±0.242**低劑量+CY組3.163±0.064**3.011±0.144##中劑量+CY組3.855±0.089##3.147±0.105##高劑量+CY組3.632±0.389#3.476±0.119*##

注:與C組比較,*p<0.05,**p<0.01;與CY模型組比較,#p<0.05,##p<0.01，表3、表4同。

表3 實(shí)驗(yàn)小鼠血清總蛋白、球蛋白和白蛋白的含量±s,n=12)Table 3 Contents of TP,GLO and ALB in the serum of experimental ±s,n=12)

表4 實(shí)驗(yàn)小鼠血液抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果±s,n=12)Table 4 Antioxidant index of the blood in experimental ±s,n=12)

胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所,為中樞免疫器官,其細(xì)胞增殖分化受抑制會(huì)使機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)尤其是淋巴細(xì)胞總數(shù)降低,使機(jī)體免疫功能下降[19]。脾臟是動(dòng)物體內(nèi)最大的外周免疫器官,是T、B淋巴細(xì)胞定居和對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答及免疫效應(yīng)物質(zhì)(如抗體等)的重要場(chǎng)所。脾臟指數(shù)能反映脾臟的發(fā)育和功能狀況,間接反映機(jī)體的免疫水平[20]。檢測(cè)胸腺和脾臟指數(shù)的變化可以直觀(guān)綜合地反映藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。與C組相比較,CY模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)都極顯著降低(p<0.01),在一定程度上可以表征注射劑量為100mg/kg·bw的CY 24h后對(duì)小鼠起到了構(gòu)造免疫抑制模型的作用。

通過(guò)表2可知,CTP能夠提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù),對(duì)CY的抑制有正調(diào)節(jié)作用。免疫器官指數(shù)的增加,說(shuō)明CTP可在一定程度上促進(jìn)小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫,為血清蛋白含量的提高提供了條件。

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠血清蛋白含量的變化

實(shí)驗(yàn)小鼠血清蛋白含量的變化見(jiàn)表3,對(duì)于總蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清總蛋白含量極顯著降低(p<0.01),低、中、高劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),不過(guò)中劑量CTP組的總蛋白含量已超過(guò)C組;與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP組血清總蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

對(duì)于球蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清球蛋白含量極顯著降低(p<0.01),三個(gè)不同劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),其中,低、中、高劑量的CTP組球蛋白含量均已超過(guò)了C組;與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP血清球蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

對(duì)于白蛋白含量,與C組比較,CY模型組小鼠血清白蛋白含量極顯著降低(p<0.01),三個(gè)不同劑量的CTP組與C組差異均不顯著(p>0.05),不過(guò)中劑量CTP組的白蛋白含量已高于C組;與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP組血清白蛋白含量均極顯著增高(p<0.01)。

通過(guò)以上結(jié)果可知,中劑量的CTP在促進(jìn)小鼠血清蛋白含量的增加上效果最為明顯。

肝臟受損傷時(shí),蛋白質(zhì)發(fā)生合成障礙可導(dǎo)致血漿球蛋白和白蛋白含量減少。臨床上以檢測(cè)血漿蛋白的含量來(lái)協(xié)助診斷肝臟疾患,并作為療效觀(guān)察,預(yù)后判斷的指標(biāo)[21]。有研究表明給大鼠腹腔注射一定量的CY,其能與大鼠組織細(xì)胞中功能基團(tuán)如DNA,蛋白質(zhì)分子中氨基、疏基、羥基等作用,發(fā)生烷化作用,造成大鼠肝功能抑制,總蛋白、白蛋白、球蛋白降低及外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)減少[22]。李樹(shù)鵬等認(rèn)為,多糖能使血清白蛋白濃度升高可能是由于多糖促進(jìn)TNF的分泌,TNF能作用于肝臟,使血清白蛋白合成增加[23]。同時(shí),血清蛋白含量的升高與機(jī)體免疫功能增強(qiáng)也有很大的關(guān)系,血清蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成,球蛋白比重很大,由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP均能提高免疫抑制小鼠血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量,在一定程度上改善CY對(duì)肝臟的損傷,促使機(jī)體恢復(fù)正常。CTP的作用機(jī)制可能是多糖調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,血清球蛋白數(shù)量增加而引起總蛋白濃度上升;還有可能是因?yàn)槎嗵堑淖o(hù)肝解毒的作用。

2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠血液抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)小鼠血液抗氧化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表4,對(duì)于SOD活性,與C組比較,CY模型組和低、中、高劑量的CTP組的紅細(xì)胞SOD活性均極顯著降低(p<0.01);與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP組的紅細(xì)胞SOD活性均極顯著提高(p<0.01)。

對(duì)于MDA含量,與C組比較,CY模型組小鼠紅細(xì)胞MDA含量極顯著增加(p<0.01),低劑量CTP組的MDA含量顯著增加(p<0.05),中、高劑量CTP組的MDA含量與C組差異不顯著(p>0.05);與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP組的紅細(xì)胞MDA含量均極顯著減少(p<0.01)。

對(duì)于CAT活性,與C組比較,CY模型組小鼠血清CAT活性極顯著降低(p<0.01),低、中劑量CTP組血清CAT活性顯著降低(p<0.05);與CY模型組比較,三個(gè)不同劑量的CTP組的血清CAT活性均顯著提高(p<0.01或p<0.05),且CAT活性隨著多糖濃度的增大而增高。

生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,自身形成了防御過(guò)氧化損害系統(tǒng)。正常狀態(tài)下,促氧化與抗氧化之間保持著一定的平衡狀態(tài),如果活性氧自由基的產(chǎn)生超過(guò)了機(jī)體的清除能力,或機(jī)體抗氧化系統(tǒng)受損時(shí),體內(nèi)自由基蓄積,會(huì)引起脂質(zhì)氧化,產(chǎn)生過(guò)量脂質(zhì)過(guò)氧化物,損傷核酸、蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分。研究表明,許多多糖對(duì)物理、化學(xué)及生物來(lái)源的多種活性氧具有清除作用,提高抗氧化酶活性及機(jī)體抗氧化能力。據(jù)報(bào)道,油菜花粉多糖能拮抗環(huán)磷酰胺,降低小鼠血清中MDA含量,使血清SOD活性恢復(fù)至正常水平[24]。猴頭菇多糖可以明顯提高小鼠血清的SOD和CAT的活性以及降低血清MDA的含量,具有良好的抗氧化能力[25]。Li等研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖(CMP)能抑制線(xiàn)粒體損傷,清除活性氧,增加體內(nèi)SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)以及CAT的活性,從而具有抗衰老的功效[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CTP能顯著提高小鼠血液SOD和CAT的活性,并降低MDA的含量,表明其能提高機(jī)體抗氧化能力,有效預(yù)防機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化,與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

研究表明[27-28]多糖對(duì)免疫抑制狀態(tài)下的小鼠可通過(guò)抗氧化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平,保護(hù)免疫系統(tǒng)細(xì)胞免受損傷,從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能;本研究中CTP提高血清球蛋白含量進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用可能與抗氧化功能的增強(qiáng)相關(guān),其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究初步證實(shí)泰山蛹蟲(chóng)草多糖能顯著降低環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的免疫抑制作用,提高環(huán)磷酰胺所致的免疫損傷小鼠的血清蛋白含量,對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用,劑量為200mg/kg·bw的泰山蛹蟲(chóng)草多糖的促進(jìn)作用最為明顯;抗氧化研究表明,泰山蛹蟲(chóng)草多糖可以通過(guò)提高一些抗氧化酶的活性和降低體內(nèi)氧化反應(yīng)產(chǎn)物的含量來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究為泰山蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)利用及其多糖制劑的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)和參考,同時(shí)多糖結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系方面的研究有待于進(jìn)一步開(kāi)展。

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Effect ofCordycepstaishanensispolysaccharide on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice

ZHANG Sheng-fang,ZHAO Long-yu,WANG Xue,ZHAO Feng-chun,YANG Zheng-you*

(Department of Microbiology,College of Life Science,Key Laboratory for Agriculture Microbiology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Objective:To study the effects ofCordycepstaishanensispolysaccharide(CTP)on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice. Methods:Through gavage experiments in mice,the effects of CTP on the amount of total proteins(TP),albumin(ALB)and globulin(GLO)in serum and antioxidant activity were analyzed. Results:Compared with the CY model group,the amount of TP,ALB and GLO in serum were increased significantly(p<0.01),the activities of superoxide dismutase(SOD)in erythrocytes and catalase(CAT)in serum were significantly increased(p<0.05 orp<0.01)and the content of malondialdehyde(MDA)in erythrocytes were decreased significantly(p<0.01)in the three CTP treatment groups. Conclusion:CTP could significantly increase protein content in serum and reduce the damage at some level to liver function of immunosuppressive mice induced by CY. CTP could also improve antioxidant activity of CY-induced immunosuppressive mice to a certain extent.

Cordycepstaishanensispolysaccharide;cyclophosphamide;immunosuppressive mice;serum proteins;antioxidant activityinvivo

2014-08-25

張圣方(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者:楊正友(1971-),男,博士,教授,研究方向:食品質(zhì)量與安全,及食品微生物學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972050,31271873);山東省自然科學(xué)基金(ZR2010CM015)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0332-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.059