曹 科，羅小娟，馬東禮，韋 樂，肖麗霞，吳躍平

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院檢驗科 518038)

探討標本保存時間對異型淋巴細胞形態(tài)學(xué)改變的影響

曹 科，羅小娟，馬東禮△，韋 樂，肖麗霞，吳躍平

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院檢驗科 518038)

目的 探討以乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周血不同保存時間對異型淋巴細胞(以下簡稱異淋)計數(shù)和細胞形態(tài)的影響。方法 收集傳染性單核細胞增多癥(以下簡稱傳單)組(n=32)與對照組(n=35)EDTA-K2抗凝標本共67份，在抗凝0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h分別涂片、染色，各鏡檢分類200個白細胞，并觀察細胞形態(tài)的變化。結(jié)果 傳單組在2.0 h內(nèi)異淋百分比、凋亡的淋巴細胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2.0 h后異淋百分比逐漸下降，凋亡的淋巴細胞百分比逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組各時間點間異淋百分比、凋亡的淋巴細胞百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 EDTA-K2抗凝血在2.0 h內(nèi)不影響異淋計數(shù)，異淋易發(fā)生凋亡，隨著抗凝時間的進一步延長，異淋百分比會逐漸降低，將影響異淋計數(shù)的準確性。

外周血；異型淋巴細胞；EDTA-K2抗凝；細胞形態(tài)

異型淋巴細胞(以下簡稱異淋)是在病毒感染、藥物反應(yīng)、過敏原刺激等因素的作用下，淋巴細胞增生并發(fā)生形態(tài)上的變化，主要表現(xiàn)為胞體的增大、胞質(zhì)量增加、胞質(zhì)嗜堿性增強、細胞核母細胞化。異淋常見于各種病毒感染，其中以傳染性單核細胞增多癥(以下簡稱傳單)時增多較明顯。隨著檢驗技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在大部分醫(yī)院均采用具有乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝劑的真空采血管采集標本后進行血液常規(guī)檢測，樊笑霞等[1]指出手指末梢血涂片異淋的檢出率較EDTA抗凝的標本低很多，異淋形態(tài)受EDTA抗凝劑影響較大，故EDTA抗凝外周血不適用于異淋的計數(shù)。楊秋連等[2]報道結(jié)果得出相反結(jié)論，EDTA抗凝血可用于異淋計數(shù)的初篩，但當發(fā)現(xiàn)血涂片中Ⅱ型異淋較多時，應(yīng)用新鮮未抗凝血進行異淋復(fù)查。薛寒等[3]發(fā)現(xiàn)EDTA抗凝劑不影響異淋計數(shù)，且在EDTA抗凝后3.0 h內(nèi)計數(shù)結(jié)果可信。為進一步明確EDTA抗凝血在保存多長時間后異淋計數(shù)會發(fā)生變化，細胞形態(tài)學(xué)又有何改變，現(xiàn)就EDTA抗凝后不同時段異淋計數(shù)的差異和細胞形態(tài)學(xué)的改變進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2012年4～12月符合傳單診斷標準[4]的傳單患兒乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝標本32例(傳單組)，選取同期非傳單患兒EDTA-K2抗凝標本35例(對照組)，兩組年齡、性別經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 奧林巴斯CX21顯微鏡、瑞氏染液(參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版配制)、EDTA-K2抗凝真空采血管(汕頭金豐醫(yī)療有限公司生產(chǎn)，內(nèi)含1.8 mg EDTA-K2干粉，1 mL規(guī)格)。

1.2.2 標本收集與處理 每份靜脈血標本經(jīng)EDTA-K2抗凝后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h分別涂片、染色，按照相應(yīng)標準操作規(guī)程[5]完成，由1名技術(shù)熟練的主管技師對每張涂片各鏡檢分類200個白細胞，并觀察細胞形態(tài)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 傳單組與對照組不同時間點白細胞手工分類結(jié)果比較 傳單組內(nèi)不同時間點間的嗜堿性粒細胞百分比(B%)、中性粒細胞百分比(N%)、嗜酸性粒細胞百分比(E%)、單核細胞百分比(M%)、凋亡的中性粒細胞百分比(凋亡N%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；淋巴細胞百分比(L%)、異淋百分比(異淋%)、凋亡的淋巴細胞百分比(凋亡L%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)兩兩比較，0.5、1.0、2.0 h 3組數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與組內(nèi)其他各組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組內(nèi)不同時間點間的B%、N%、E%、M%、凋亡N%、L%、異淋%、凋亡L%差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)傳單組與對照組組間比較，凋亡L%在0.5、1.0、2.0 h兩組數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余時間兩組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而凋亡N%在不同時間點兩組數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，傳單組、對照組0.5 h異淋%與不同時間點凋亡L%均無相關(guān)性(P>0.05)，傳單組、對照組內(nèi)0.5 h L%與不同時間點凋亡L%均無相關(guān)性(P>0.05)。隨著EDTA-K2抗凝時間的延長，傳單組L%和異淋%逐漸下降，凋亡L%逐漸升高，而對照組無這種趨勢。見表1。

2.2 白細胞形態(tài)學(xué)改變 隨著EDTA-K2抗凝時間的延長，傳單組部分異淋開始出現(xiàn)凋亡，主要表現(xiàn)為細胞體積縮小、胞質(zhì)凝縮、染色質(zhì)凝聚并出現(xiàn)凋亡小體(圖1)，中性粒細胞則極少出現(xiàn)凋亡。而對照組的淋巴細胞和中性粒細胞均極少出現(xiàn)凋亡。說明傳單組的異淋更易發(fā)生凋亡，導(dǎo)致異淋的形態(tài)改變，影響異淋計數(shù)的準確性。

表1 兩組不同時間點白細胞手工分類結(jié)果比較(±s)

A：細胞體積縮小，染色質(zhì)凝聚，胞質(zhì)見數(shù)個較大出芽式的凋亡小體；B：細胞體積縮小，染色質(zhì)凝聚呈均一致密物，核碎裂為大小不一片段；C：細胞體積明顯縮小，染色質(zhì)凝聚呈均一致密物，胞質(zhì)見多個細小凋亡小體。

圖1 凋亡淋巴細胞(瑞氏染色，×100)

3 討 論

異淋的形成是由于病毒與B淋巴細胞受體結(jié)合，在不斷增殖與復(fù)制的過程中，被T異淋識別，激發(fā)抑制性T細胞(TS/c)增殖并自身發(fā)生轉(zhuǎn)化，形成細胞毒效應(yīng)，出現(xiàn)在循環(huán)血液中的大多為受刺激后異常增殖的T細胞和少許B細胞的異淋[6-7]。近年眾多研究顯示[8-10]，異淋與EB病毒、巨細胞病毒、輪狀病毒、支原體等多種病原體感染有關(guān)，其中以EB病毒感染最為明顯。根據(jù)血清學(xué)調(diào)查，我國3～5歲兒童的血清抗體陽性率達90%以上[11]，可見傳單是兒科的常見疾病，異淋計數(shù)作為診斷和監(jiān)測某些病毒感染性疾病療效簡便而有效的指標，已廣泛用于臨床。因此，保證異淋計數(shù)的準確性對臨床工作有重要意義。

EDTA是國際血液學(xué)標準化委員會(ICSH)推薦使用的抗凝劑，對血細胞形態(tài)影響小，是血液常規(guī)檢查的首選抗凝劑。近年來，部分學(xué)者[1-3]對EDTA抗凝劑對異淋計數(shù)的影響做了相應(yīng)的研究，但結(jié)論不太一致。由于正確的標本采集與處理是保證檢驗結(jié)果準確性的重要前提條件。為進一步探討EDTA抗凝血不同保存時間對異淋計數(shù)和形態(tài)學(xué)的影響，作者做了這方面的研究。

從本研究結(jié)果來看，隨著EDTA-K2抗凝作用時間的延長，傳單組外周血涂片中異淋形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)了凋亡淋巴細胞，凋亡的細胞形態(tài)與王霄霞[12]所描述的一致，并隨抗凝時間延長而逐漸增多，而出現(xiàn)的凋亡并不單純來源于典型的異淋(出現(xiàn)的凋亡淋巴細胞多于減少的典型異淋)，部分不太典型的異淋也出現(xiàn)凋亡。有趣的是對照組凋亡的淋巴細胞并未隨著EDTA-K2抗凝時間(在6.0 h內(nèi))的延長而升高。說明經(jīng)EB病毒刺激產(chǎn)生的異淋較正常淋巴細胞更易發(fā)生凋亡，異淋在體外某些因素的作用下可能使其凋亡加速，這些因素可能包括：(1)EDTA-K2抗凝劑的刺激；(2)離體血液標本因細胞代謝和(或)抗凝劑導(dǎo)致滲透壓、pH的改變；(3)采血試管的接觸活化、體內(nèi)外溫度的改變等。這些因素有待進一步研究。而對照組因原本異淋%就很低，而正常淋巴細胞又不易發(fā)生凋亡，所以不同時間點間異淋%、凋亡L%差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

本研究結(jié)果顯示，在EDTA-K2抗凝2 h內(nèi)異淋計數(shù)結(jié)果準確，這與之前的研究結(jié)果有一定出入，可能的原因有：(1)實驗設(shè)計的不同，本研究對傳單組和非傳單分別進行研究，較其他學(xué)者不分組進行實驗更科學(xué)、合理。(2)選取的研究對象的不同。(3)白細胞分類個數(shù)、形態(tài)學(xué)識別能力、異淋判斷標準可能有一定差異，本研究每份標本均由同一位技術(shù)熟練的工作人員計數(shù)200個白細胞進行統(tǒng)計分析，消除異淋判斷標準的差異所帶來的計數(shù)誤差，從分析結(jié)果來看，除了傳單組部分時間點L%、異淋%、凋亡L%結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他各組數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，也可間接證明本研究結(jié)果準確、可靠。(4)抗凝劑濃度、抗凝管品牌的差異。

從相關(guān)性分析中可知，出現(xiàn)凋亡L%與初始異淋和L%均不相關(guān)，但可能與疾病所處時期、體內(nèi)病毒數(shù)量、機體的免疫功能等因素有關(guān)，遺憾的是，由于實驗設(shè)計的缺陷和數(shù)據(jù)的不完整，作者并未對以上因素進行分析。

總之，本研究結(jié)果表明，EDTA-K2抗凝血在2.0 h內(nèi)不影響異淋計數(shù)，隨著抗凝時間的進一步延長，因異淋易發(fā)生凋亡，異淋%會逐漸降低，影響異淋計數(shù)的準確性，但有待進一步擴大樣本量進行驗證并探討導(dǎo)致異淋形態(tài)學(xué)改變(出現(xiàn)凋亡淋巴細胞)的原因。

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深圳市發(fā)改委重點實驗室資助項目([2012]866)。 作者簡介：曹科(1981-)，本科，主管技師，主要從事臨床檢驗診斷學(xué)工作?！?/p>

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驗交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.032

R446.11

B

1671-8348(2015)14-1958-03

2014-12-10

2015-03-29)