劉杭達(dá),馬千蘇,王 傑,周 韻,孫 璐,程永強(qiáng)

(植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

紫山藥粗多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性的研究

劉杭達(dá),馬千蘇,王 傑,周 韻,孫 璐,程永強(qiáng)*

(植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

本文紫山藥粗多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化性的研究,以紫山藥為研究材料,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了紫山藥粗多糖提取工藝,確定在料液比1∶15(mg/mL)、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間為2 h的條件下紫山藥粗多糖得率最高達(dá)到2.58%±0.03%。分別利用DPPH,超氧自由基,EDTA,ABTS四種方法對(duì)提取的紫山藥粗多糖進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,在DPPH和ABTS實(shí)驗(yàn)中紫山藥粗多糖對(duì)自由基有明顯的清除效果,在DPPH實(shí)驗(yàn)中紫山藥多糖濃度為2 mg/mL時(shí)清除率到達(dá)66.24%,在ABTS實(shí)驗(yàn)中紫山藥濃度為24 mg/mL時(shí)清除率到達(dá) 69.50%,優(yōu)于普通山藥多糖。

紫山藥,粗多糖,提取,抗氧化性能

山藥是一種多年生纏繞草質(zhì)藤本植物,含有多種保健功能及成分,現(xiàn)代研究表明山藥具有降低血糖[1]、提高胃腸功能[2]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]以及抗衰老[4]的作用。紫山藥是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種藥食同源的薯蕷科植物,屬于紫紅肉山藥品種,研究表明紫山藥中主要的活性成分多糖含量高于其他品種[5-6],具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。經(jīng)研究表明,因?yàn)槎嗵蔷哂休^高的抗氧化能力,使其具備卓越的醫(yī)療和保健功能,得到了廣大科研人員關(guān)注及研究。目前大量的多糖產(chǎn)品已經(jīng)逐步應(yīng)用到醫(yī)療和保健領(lǐng)域,在保障人們健康上發(fā)揮著重要的作用。目前,關(guān)于山藥多糖的研究較多,主要集中在提取分離技術(shù)[7],組成結(jié)構(gòu)及其生物活性,部分研究發(fā)現(xiàn)粗多糖比純多糖更具活性[8-9]。但是關(guān)于紫山藥多糖的提取和抗氧化特性研究的報(bào)道還較少。因此,本文考察了在生產(chǎn)上常用的多糖的提取方法對(duì)紫山藥粗多糖的提取得率的影響,利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,并利用ABTS自由基清除活性、DPPH自由基清除、超氧自由基清除能力等實(shí)驗(yàn)對(duì)提取的粗多糖的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià),為紫山藥多糖提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫山藥(紫玉淮山) 購(gòu)于廣州市方緣貿(mào)易有限公司,紫山藥洗凈后去皮、切片、真空冷凍干燥并粉碎[10],制備成粉在干燥箱內(nèi)常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

氯仿,正丁醇,活性炭,無(wú)水乙醇,3,5-二硝基水楊酸,三羥甲基氨基甲烷(Tris),焦性沒(méi)食子酸,蕃紅,十二水合磷酸氫二鈉,二水合磷酸二氫鈉,乙二胺四乙酸(EDTA),七水合硫酸亞鐵,還原性鐵粉,30%雙氧水,鹽酸,乙腈等(分析純) 均購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);ABTS,Trolox等 購(gòu)于Sigma 2 Aldrich公司。

電熱恒溫水浴鍋(DZKW-D-2) 常州國(guó)華電器有限公司;CPA26P電子天平 賽多利斯;AdVantagePro臺(tái)式凍干機(jī) 美國(guó)VirTis;TDL-5000B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DHG-9030電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)

1.2.1.2 多糖含量的測(cè)定 使用苯酚-硫酸法[10],用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物,在恒溫25 ℃,在490 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.1.3 換算因素及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)室精制紫山藥多糖在60 ℃下干燥至恒重,精確稱(chēng)取多糖50 mg,用水溶解后定容到100 mL,搖勻做為多糖儲(chǔ)備液。精確量取多糖儲(chǔ)備液0.2 mL,加水至1 mL,按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同樣的方法測(cè)其吸光度值。

查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得葡萄糖質(zhì)量濃度,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=W/m

其中:W為多糖質(zhì)量(g),m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 提取溫度對(duì)紫山藥粗多糖提取率的影響 精確稱(chēng)取15 g紫山藥粉,置于250 mL燒杯中,料液比為1∶10(mg/mL),分別在40、45、50、55、60 ℃五種情況下,提取3 h,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,提取步驟同1.2.1.1。吸取1 mL提取的多糖溶液,將其裝入10 mL的刻度試管中,用水定容至10 mL。再吸取1 mL進(jìn)行苯酚-硫酸法比色測(cè)定。

1.2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紫山藥粗多糖提取率的影響 精確稱(chēng)取15 g紫山藥粉,置于250 mL燒杯中,料液比為1∶10(mg/mL),在提取溫度50 ℃下分別浸提1、2、3、4、5 h,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,提取步驟同1.2.1.1。吸取1 mL提取的多糖溶液,將其裝入10 mL的刻度試管中,用水定容至10 mL。再吸取1 mL進(jìn)行苯酚-硫酸法比色測(cè)定。

1.2.2.3 料液比對(duì)紫山藥粗多糖提取率的影響 精確稱(chēng)取15 g紫山藥粉,置于不同大小中,在提取溫度50 ℃、提取時(shí)間2 h條件下,分別采用料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(mg/mL)五種不同濃度進(jìn)行提取。每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,提取步驟同1.2.1.1。吸取1 mL提取的多糖溶液,將其裝入10 mL的刻度試管中,用水定容至10 mL。再吸取1 mL進(jìn)行苯酚-硫酸法比色測(cè)定。

1.2.2.4 提取次數(shù)對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響 精確稱(chēng)取15 g紫山藥粉,置于250 mL 燒杯中,在提取溫度50 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比為1∶10(mg/mL)條件下,分別提取1次、2次、3次,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,提取步驟同1.2.1.1。吸取1 mL提取的多糖溶液,將其裝入10 mL的刻度試管中,用水定容至10 mL。再吸取1 mL進(jìn)行苯酚-硫酸法比色測(cè)定。

1.2.2.5 紫山藥粗多糖提取工藝優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化提取工藝。L9(33)因素水平表如表1。

表1 因素水平表

1.3 紫山藥粗多糖的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 紫山藥粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用測(cè)定 用連續(xù)加液器快速在不同樣品濃度1、2、3、4(mg/mL)中加入2.5 mL DPPH溶液,避光反應(yīng)30 min后,用在517 nm下測(cè)定吸光值,并計(jì)算不同樣品濃度下相應(yīng)的抑制率大小。每種樣品做3個(gè)平行,空白用5 mL蒸餾水代替樣品溶液[8，11]。

式中:A空白為空白組的吸光值;A樣品為樣品組的吸光值;A對(duì)照為樣品組的吸光值。

式中:S0-空白組的線(xiàn)性曲線(xiàn)斜率;S-樣品組的線(xiàn)性曲線(xiàn)斜率。

1.3.3 測(cè)定紫山藥粗多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 按照表2數(shù)據(jù)制作反應(yīng)體系,充分混勻,在37 ℃水浴鍋中水浴30 min,在波長(zhǎng)520 nm下測(cè)定吸光值,計(jì)算樣品清除率。

式中:A樣品-樣品管的吸光值;A樣參-樣品參照管的吸光值;A損-損傷管的吸光值;A未損-未損傷管的吸光值;A空白-空白管的吸光值[8,11]。

表2 反應(yīng)體系

注:表中加樣量均為mL。

1.3.4 用ABTS法測(cè)定紫山藥粗多糖抗氧化性 取ABTS+自由基工作液4 mL置于10 mL具塞比色管中,分別加入80 μL的Trolox或樣品溶液。均勻振蕩10 s,30℃水浴反應(yīng)6 min,測(cè)定其各自吸光度值,平行3組,取平均值計(jì)算清除能力[11-13]。

式中:At是水浴反應(yīng)6 min后,測(cè)定反應(yīng)混合液的吸光度;A0是ABTS+自由基工作液的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel2003、Origin 8.0軟件進(jìn)行處理,所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次以上,結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與換算因素

實(shí)驗(yàn)制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到回歸曲線(xiàn)和直線(xiàn)方程,詳見(jiàn)圖1，A=0.164+5.270C(C:葡萄糖溶液濃度)相關(guān)系數(shù)r=0.9961。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of glucose determination

回歸分析表明,在0.05～0.5 mg/L范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸收度值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 提取溫度對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響 由圖2可見(jiàn),隨著提取溫度的升高,多糖得率逐漸增大。在50 ℃后,多糖得率變化不大。在55 ℃下,多糖得率略有下降?？赡苁请S著提取溫度的升高,紫山藥多糖開(kāi)始降解以及蛋白質(zhì)逐漸溶出。考慮到經(jīng)濟(jì)成本和防止多糖在高溫下遭受破壞喪失活性,提取溫度不宜過(guò)高。

圖2 提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紫山藥粗多糖提取量的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率不斷上升,但在2 h后逐漸趨于平穩(wěn),上升趨勢(shì)不明顯。這可能是紫山藥中大多數(shù)多糖已溶出達(dá)到平衡?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本和提取效果,選擇提取時(shí)間為2 h較為合適。

圖3 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on polysaccharide yield

2.2.3 料液比對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響 從圖4可以看出,料液比的提高會(huì)增加多糖的得率,在料液比為1∶10以后上升趨于平穩(wěn);考慮到提高料液比會(huì)對(duì)后續(xù)的工藝增加能耗,所以選擇料液比1∶10(g∶mL)較為合適。

圖4 料液比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of water-material ratio on polysaccharide yield

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響 由圖5可以看出,隨提取次數(shù)的增加,多糖的得率也有所增加,但增加效果并不顯著。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再以提取次數(shù)作為正交實(shí)驗(yàn)的研究因素。

圖5 提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of times on polysaccharide yield

2.3 紫山藥粗多糖提取工藝條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)紫山藥粗多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析見(jiàn)表3。根據(jù)表3的極差R的大小,影響多糖得率的因素主次順序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間。

表3 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)表

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析(表4)表明:提取溫度與料液比的差異較顯著,通過(guò)F比數(shù)值表明提取溫度、料液比對(duì)多糖提取得率影響顯著,說(shuō)明提取溫度和料液比對(duì)紫山藥粗多糖提取起主要作用,提取溫度的影響要高于料液比。提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)結(jié)果影響不顯著。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝為為A3B3C3，即料液比1∶15、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間3 h。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在此條件下紫山藥多糖的得率為2.58%±0.03%。

2.4 紫山藥粗多糖抗氧化性的研究

2.4.1 紫山藥粗多糖濃度與清除DPPH自由基能力之間的關(guān)系 由圖6可知,隨著各個(gè)樣品的濃度不斷增加,各樣品清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)。在1 mg/mL的濃度時(shí),去除花青素組清除率為34.48%,未去花青素組為41.46%。在濃度達(dá)到2 mg/mL后,所有樣品的清除能力都趨于平穩(wěn)且清除率達(dá)到峰值66.24%。從圖上可以明顯看出,去花青素組與未去花青素組的清除自由基的能力都低于Trolox,但由于花青素也是一種天然抗氧化劑[14],使得未去花青素組的自由基清除率要高于去除花青素組,進(jìn)而提高了未去花青素組的抗氧化效果。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

注:*表示差異顯著。

圖6 紫山藥粗多糖濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of polysaccharide concentration on DPPH free radical scavenging

2.4.3 紫山藥粗多糖與清除羥自由基能力之間的關(guān)系 由表6可以看出,在羥自由基清除實(shí)驗(yàn)中,紫山藥粗多糖的濃度對(duì)羥自由基清除效果無(wú)顯著影響,說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)條件下,紫山藥粗多糖中的多糖成分無(wú)法與實(shí)驗(yàn)中的(·OH)有良好的反應(yīng),對(duì)其實(shí)驗(yàn)中所存的反應(yīng)體系影響不大,在520 nm波長(zhǎng)處吸光值無(wú)明顯的變化,沒(méi)有明顯的清除作用。

2.4.4 ABTS法測(cè)定紫山藥粗多糖的抗氧化性 由圖7可知,相比于Trolox,在濃度達(dá)到6 mg/mL后,抗氧化能力趨于平穩(wěn)。未去花青素組與去花青素組隨著樣品的濃度不斷增加,樣品的抗氧化能力逐漸增強(qiáng),并在濃度達(dá)到24 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到峰值69.50%。從圖上也可以明顯看出,在ABTS實(shí)驗(yàn)中,去花青素組與未去花青素組的清除自由基的能力都低于Trolox,但由于未去花青素組含有花青素成分,使其抗氧化效果要高于去除花青素組。

表5 紫山藥粗多糖濃度對(duì)超氧自由基清除能力的影響

表6 紫山藥粗多糖濃度對(duì)羥自由基清除能力的影響

圖7 ABTS法測(cè)定紫山藥粗多糖抗氧化性Fig.7 The antioxidations of purple yam polysaccharide by ABTS method

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)紫山藥粗多糖提取方法進(jìn)行改進(jìn),提高了紫山藥粗多糖的得率,綜合考慮實(shí)驗(yàn)及未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)情況,最終確定提取紫山藥粗多糖優(yōu)化后的工藝為:料液比1∶15、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間為3 h,在此條件下粗多糖得率達(dá)到2.58%±0.03%。未來(lái)可以考慮用酶法、超聲波的輔助手段進(jìn)一步提高紫山藥多糖的得率。

分別利用DPPH,超氧自由基,EDTA,ABTS四種方法對(duì)提取的紫山藥粗多糖進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比分析,紫山藥粗多糖對(duì)DPPH和ABTS有明顯的清除效果,并且在DPPH實(shí)驗(yàn)中多糖濃度在4 mg/mL、在ABTS實(shí)驗(yàn)中多糖濃度在25 mg/mL條件下對(duì)自由基的清除率在75.76%左右。未去花青素組由于含有花青素成分,使其抗氧化效果要高于去除花青素組。由于在多糖提取過(guò)程中大部分花青素被除去,所以未去花青素組中殘留的花青素成分對(duì)紫山藥粗多糖自由基清除能力的貢獻(xiàn)有限,與去花青素組相比沒(méi)有明顯提高粗多糖的抗氧化能力,說(shuō)明在粗多糖中起主要抗氧化作用的成分是紫山藥多糖。在紫山藥多糖對(duì)超氧自由基和羥自由基清除實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有體現(xiàn)出多糖對(duì)自由基的良好清除效果。這可能說(shuō)明DPPH和ABTS法能更好的檢驗(yàn)紫山藥多糖的抗氧化效果,同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步從多糖的結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行研究,探討多糖結(jié)構(gòu)對(duì)自由基清除作用的影響。在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)時(shí)間、光照強(qiáng)度、pH等因素會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一些影響,造成粗多糖在不同實(shí)驗(yàn)條件下有不同的抗氧化活性[15]。若條件允許,未來(lái)可用高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法等效率高且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法研究紫山藥多糖對(duì)抗氧化劑DPPH自由基清除的效果[16]。ABTS法操作簡(jiǎn)便、快捷,且結(jié)果重復(fù)性好,適合本實(shí)驗(yàn)紫山藥多糖體外抗氧化性測(cè)定[13]。但是該方法TEAC值在反應(yīng)條件不同時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的變動(dòng),只有待測(cè)物濃度達(dá)到一定范圍值時(shí)才可以保持TEAC值相對(duì)穩(wěn)定[17]。所以需要對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)處理,找到相對(duì)穩(wěn)定的樣品實(shí)驗(yàn)濃度。

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Optimization of extraction conditions and investigation of antioxidant activity of polysaccharides from purple yam

LIU Hang-da,MA Qian-su,WANG Jie,ZHOU Yun,SUN Lu,CHENG Yong-qiang*

(College of Food Science & Nutritional Engineering,Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The polysaccharide extraction from purple yam was optimized based on single factor experiment combined with orthogonal design. The optimum extraction conditions were achieved when the ratio of solid to liquid was 1∶15(mg/mL)at 55 ℃ for 2 h. Under such conditions,the yield ratio of purple yam polysaccharide reached as high as 2.58%±0.03%. The antioxidant activity of crude polysaccharide from purple yam was extensively investigated by antioxidant experiments tests based on DPPH,superoxide radical,ABTS and EDTA. The experimental results showed that the polysaccharides from purple yam exhibited significant antioxidant activity in the DPPH and ABTS tests with free radical scavenging rates being 66.24% at 2 mg/mL and 69.50% at 24 mg/mL,respectively,which was better than the polysaccharides from Yam.

purple yam;crude polysaccharide;extraction;antioxidant activity

2015-03-23

劉杭達(dá)(1993-),男,本科,研究方向:紫山藥多糖,E-mail:liuhangda93@163.com。

*通訊作者:程永強(qiáng)(1972-),男,博士,教授,研究方向:食品物性評(píng)價(jià);天然產(chǎn)物提取,功能食品的評(píng)價(jià)與開(kāi)發(fā);糧食加工;酶在農(nóng)產(chǎn)品綜合加工利用中的應(yīng)用,E-mail:chengyq@cau.edu.cn。

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃支持項(xiàng)目(201310019054)；國(guó)家自然科學(xué)基金支持項(xiàng)目(31171739)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)23-0208-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.035