朱玲玲,張廣文,楊婷婷,邱瑞霞

(暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

微波提取白鵑梅黃酮類物質及其抗氧化活性研究

朱玲玲,張廣文*,楊婷婷,邱瑞霞

(暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

白鵑梅,黃酮類化合物,微波提取,響應面法,抗氧化活性

白鵑梅為薔薇科白鵑梅(Exochorda racemosa)屬,該屬植物全世界共4種,其中3種(白鵑梅、齒葉白鵑梅、紅柄白鵑梅)在我國分布[1],主要生長在河南、江西、江蘇、浙江一帶。白鵑梅的花蕾和嫩葉均可食用。研究表明每百克白鵑梅嫩葉不僅含胡蘿卜素、維生素等豐富的營養(yǎng)物質而且含有豐富的黃酮類化合物[1-2]。實驗人員采用溶劑提取法,溶劑萃取法以及超聲波輔助等方法對不同白鵑梅進行黃酮類化合物的提取[3]。

本實驗利用微波技術對白鵑梅總黃酮進行提取,在單因素實驗的基礎上,以白鵑梅總黃酮提取量為響應值,利用響應面分析法(RSM)[4-5]對微波提取白鵑梅黃酮工藝條件進行優(yōu)化,并采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系來獲得最優(yōu)工藝參數,并且對其抗氧化活性進行體外測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白鵑梅葉 河南平頂山舞鋼市，于熱風干燥箱65 ℃烘干,用粉碎機粉碎,過60目篩后備用；蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇,乙酸乙酯,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉均為分析純。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 氨丁三醇(Tris),連苯三酚,2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)。

LD-Y1000A高速萬能粉碎機 上海頂帥電器有限公司;MAS-Ⅱ常壓微波 上海新儀微波化學科技有限公司;UV-9600紫外分光光度計 北京瑞利儀器有限公司;EL104電子分析天平 METTLER TOLEDD有限公司;SB-5200超聲雙頻清洗器 寧波新芝生物科技股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白鵑梅總黃酮提取工藝流程 干燥白鵑梅→粉碎過篩→加提取溶劑→浸提→抽濾→濃縮干燥→黃酮粗提物

1.2.2 蘆丁標準曲線測定 精密稱取在105 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.0050 g,加80%乙醇溶解定容至50 mL,配制成質量濃度為0.1 mg/mL的標準品溶液。分別吸取該標準品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于5只25 mL容量瓶中,加質量分數5% NaNO2溶液1 mL,搖勻放置6 min,加質量分數10%的Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻放置6 min后,再加質量分數4%的NaOH溶液10 mL,并加水定容至25 mL,搖勻放置15 min,將不同質量濃度的蘆丁標準溶液在510 nm處,以蒸餾水為空白參比,測定其吸光度,并繪制黃酮質量濃度與吸光度的標準曲線[6]。

1.2.3 總黃酮含量的測定 取待測液2 mL于25 mL容量瓶中,加質量分數為5%NaNO2溶液1 mL,搖勻放置6 min,加質量分數10%的Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻放置6 min,加質量分數4%的NaOH溶液10 mL,再加水稀釋至25 mL,搖勻放置15 min后,測定吸光度,代入公式(1),計算出黃酮濃度c,將其代入公式(2):

A=10.975c+0.0037

式(1)

總黃酮含量=n×c×v/1000M

式(2)

式中:A為吸光度;n為稀釋倍數;M為原料質量(g);c為總黃酮質量濃度(mg/mL);V為提取液體積(mL);總黃酮含量(mg/g)。

1.2.4 單因素實驗設計 以提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時間、微波功率5個因素進行單因素實驗,做平行實驗3次,確定影響白鵑梅總黃酮提取量的適宜單因素條件。

1.2.4.1 提取溶劑對提取效果的影響 稱取白鵑梅粉末(60目)10.00 g,按料液比1∶25(g/mL)分別加入體積比為0∶1、1∶0、1∶1、2∶3、1∶2、1∶4的乙酸乙酯、無水乙醇混合溶液于250 mL燒瓶中,在45 ℃,300 W的微波功率下提取60 min。

1.2.4.2 微波功率對提取效果的影響 稱取白鵑梅粉末(60目)10.00 g,按料液比1∶25(g/mL)加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、無水乙醇混合溶液于250 mL燒瓶中,于45 ℃,分別在100、200、300、400、500 W的微波功率下提取60 min。

1.2.4.3 提取時間對提取效果的影響 稱取白鵑梅粉末(60目)10.00 g,按料液比1∶25(g/mL)加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、無水乙醇混合溶液于250 mL燒瓶中,在45 ℃,300 W的微波功率下分別提取30、40、50、60、70 min。

1.2.4.4 料液比對提取效果的影響 稱取白鵑梅粉末(60目)10.00 g,按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)分別加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、無水乙醇混合溶液于250 mL燒瓶中,在45 ℃,300 W的微波功率下提取60 min。

1.2.4.5 提取溫度對提取效果的影響 稱取白鵑梅粉末(60目)10.00 g,按料液比1∶25(g/mL)加入體積比為1∶1的乙酸乙酯、無水乙醇混合溶液于250 mL燒瓶中,分別在35、40、45、50、55 ℃,300 W 的微波功率下提取60 min。

1.2.5 響應面分析與優(yōu)化的設計 根據單因素實驗結果,利用Box-Behnken中心組合實驗,設計料液比、溫度、提取時間、微波功率四因素三水平中心組合實驗,利用Design-Expert軟件進行響應面分析,建立四元二次回歸方程,確定白鵑梅黃酮的最佳提取工藝條件。

表1 四因素三水平中心組合實驗因素水平編碼表

1.2.6 白鵑梅中黃酮類化合物的抗氧化實驗 采用響應面法得到的最佳提取工藝進行總黃酮的提取;將提取液濃縮并經Sevage 法(正丁醇∶氯仿=1∶5)脫蛋白,重復脫除3次;上AB-8大孔樹脂[7]層析柱,利用90%的乙醇進行洗脫,收集洗脫液,經檢測洗脫液中總黃酮含量達到91.45%;旋蒸干燥得到白鵑梅總黃酮粉末。

1.2.6.1 清除DPPH·能力測定 不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)樣品溶液2 mL,加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL,并以2 mL的無水乙醇作為對照,以蒸餾水作為參比。在室溫下避光30 min,517 nm波長下測定吸光值。以VC,BHT作為陽性參照。3次平行實驗取平均值。

清除率(%)=1-(Asample-Ablank)/Acontrol×100

注:ASample:樣品溶液+DPPH的吸光度;AbLank:樣品溶液+乙醇的吸光度;Acontrol:蒸餾水+DPPH·的吸光度。

1.2.6.2 清除羥自由基(·OH)能力測定 不同濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL)樣品溶液2 mL,依次加入2.0 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,2.0 mL 6 mmol/L的H2O2溶液,搖勻,反應10 min,加入2.0 mL 6 mmol/L的水楊酸乙醇溶液,搖勻,反應30 min,510 nm下測吸光值,以VC、BHT作為陽性參照,3次平行實驗取平均值。

清除率(%)=1-(Asample-Ablank)/Acontrol×100

注:ASample:樣品溶液的吸光度;Ablank:無水楊酸時吸光度;Acontrol:空白對照吸光度。

清除率(%)=1-Asample/Acontrol×100

注:Acontrol:蒸餾水代替樣品溶液吸光值;Asample:樣品溶液吸光值。

2 結果與分析

2.1 總黃酮標準曲線方程

如圖1所示,回歸方程為A=10.975C+0.0037,(R2=0.9998)。式中A為吸光度;C為總黃酮的質量濃度(mg/mL)。結果表明,蘆丁質量濃度在0.02～0.1 mg/mL之間時,線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard cure of rutin

2.2 單因素實驗結果

由圖2看出,當混合溶劑(V乙酸乙酯∶V乙醇=1∶1)時,白鵑梅總黃酮提取量最高。提取溶劑對實驗結果影響不顯著。實驗最終提取溶劑為乙酸乙酯∶乙醇(v∶v)=1∶1。

圖2 提取溶劑對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of solvent on yield of total flavonoids from Exochorda racemosa

由圖3可知,微波功率達到300 W時,總黃酮的提取量達到最大值。功率增大總黃酮的提取量呈明顯的下降趨勢,可能是功率過大,微波產生的熱量過多,降低質點間的能量傳遞[9]從而導致黃酮類物質的提取量降低。而且微波功率對提取結果影響顯著。因此選擇適宜的微波功率為300 W。

圖3 微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power on yield of total flavonoids from Exochorda racemosa

由圖4可知,提取時間對總黃酮提取量影響顯著。時間超過60 min后,總黃酮提取量開始下降,可能是由于時間太長導致黃酮類物質的熱分解[10-11]損失,所以選擇適宜提取時間為60 min。

圖4 提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of time on yield of total flavonoids from Exochorda racemosa

由圖5知,當料液比在1∶25 g/mL,總黃酮的提取量達到最大,料液比進一步增加,黃酮類化合物總提取量變化不大。并且,料液比對實驗結果影響不顯著;為了節(jié)約原料及成本選取適宜的料液比為1∶25 g/mL。

圖5 料液比對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on yield of total flavonoids from Exochorda racemosa

由圖6可知,提取溫度達到45 ℃時,總黃酮的提取量最大;溫度繼續(xù)升高,總黃酮提取量下降。主要原因是溫度過高,一部分黃酮氧化分解[12-13]或是溶劑揮發(fā)劇烈而用于提取的有效溶劑相對減少所致。由圖可知,溫度對提取結果的影響顯著。因此選擇適宜的提取溫度為45 ℃。

圖6 溫度對總黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of temperature on yield of total flavonoids from Exochorda racemosa

2.3 Box-Behnken實驗設計結果與響應面法分析

2.3.1 Box-Behnken實驗設計結果 根據單因素實驗結果,利用Box-Behnken中心組合實驗的設計原理,設計微波功率、提取時間、料液比、提取溫度四因素三水平29個實驗點的響應面分析實驗。實驗結果見表2。

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗 將所得的實驗數據采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析,得到以總黃酮提取量(Y)為目標函數的多元二次回歸方程:

Y=14.45200+0.23000X1+0.70083X2-0.036667X3+0.24083X4+0.45000X1X2-0.21500X1X3+0.40000X1X4+0.17750X2X3+0.16000X2X4-0.067500X3X4-0.25850X12-1.43225X22-0.41350X32-0.37475X42

2.3.3 響應面分析與優(yōu)化 表3方差分析中可以看出微波功率X1、提取時間X2、提取溫度X4的P直均小于0.01,說明這三個因素對黃酮提取量的影響顯著,影響順序從大到小依次為:X2>X4>X1。交互項對白鵑梅總黃酮提取量的影響均不顯著。二次項X22、X32、X42對總黃酮提取量具有極顯著影響。

由表3可知,所選因素對響應值影響強弱次序為:提取時間>提取溫度>微波功率>料液比;微波功率與提取時間、微波功率與料液比、微波功率與微波溫度、微波時間與料液比、微波時間與溫度、料液比與微波溫度交互作用影響不顯著。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

由嶺嵴分析得到白鵑梅黃酮類化合物最佳微波提取工藝條件:微波功率357 W,提取時間62.7 min,料液比1∶26 g/mL,提取溫度47 ℃,理論最佳提取量為14.67 mg/g。

2.3.4 驗證實驗 根據實際情況設定微波功率357 W,提取時間63 min,料液比1∶26 g/mL,提取溫度47 ℃進行3次平行實驗,取平均值,得到白鵑梅總黃酮提取量為14.59 mg/g,與預測值較為接近,擬合性好。實驗結果驗證了所建模型的正確性,說明響應面法適用于微波提取白鵑梅黃酮類化合物工藝條件的回歸分析和參數優(yōu)化。

表3 回歸方程方差分析

注:**.差異極顯著,p<0.01;*. 差異顯著,p<0.05。

2.4 白鵑梅總黃酮抗氧化活性分析

由圖7可以看出,隨著濃度的增加,VC、白鵑梅總黃酮以及BHT對DPPH·的清除能力呈線性增加,其中VC對DPPH·的清除效果最好,白鵑梅黃酮對DPPH·的清除效果好于BHT,當濃度達到1.2 mg/mL時,白鵑梅黃酮對DPPH·的清除率達到94.23%,VC以及BHT分別為95.79%,41.21%。由圖可以看出,三者對DPPH·的清除能力大小順序為:VC>白鵑梅黃酮>BHT。由表4可以看出總黃酮對DPPH·的IC50值為0.52 mg/mL。

圖7 對DPPH的清除效果Fig.7 Scavenging capacity of VC,total flavonoids,BHT for DPPH·

由圖8可以看出,白鵑梅總黃酮對羥自由基的清除力也是線性增加的,與VC相比,總黃酮以及BHT的清除效果微差,當濃度為1.2 mg/mL時,三者的清除率分別為94.07%、85.35%、75.36%。對·OH的清除能力大小順序為:VC>白鵑梅黃酮>BHT。由表4可以看出總黃酮的IC50值為0.55 mg/mL。

由圖9可以看出,白鵑梅總黃酮對過氧化自由基的清除效果遠遠低于VC以及BHT,當濃度為1.2 mg/mL時,清除率僅為51.02%。此時,VC以及BHT的清除率為95.41%,89.15%?？梢?總黃酮對過氧化自由基的清除能力有限。三者對過氧化自由基清除能力大小順序為:VC>BHT>白鵑梅黃酮。由表4可以看出,總黃酮對過氧化自由基的IC50值為1.18 mg/mL。

圖8 對·OH的清除效果Fig.8 Scavenging capacity of VC,total flavonoids,BHT for ·OH

圖9 對·的清除效果Fig.9 Scavenging capacity of VC,total flavonoids,BHT for ·

自由基線性回歸方程相關系數(R2)IC50值(mg/mL)DPPH·Y=66.69X=15.080.99300.52·OHY=57.32X+18.330.99220.55O-2·Y=21.66X=24.390.98101.18

綜上所述,從IC50值可以看出,白鵑梅總黃酮對三種自由基的清除能力不同,這主要因為黃酮類化合物對自由基的清除能力與其結構[14-15]有關,羥基的數量、位置直接影響抗氧化活性的高低。

3 結論

通過單因素實驗和Box-Behnken中心組合實驗以及響應面分析對微波輔助提取白鵑梅中黃酮類化合物提取工藝進行優(yōu)化,得出最佳工藝條件為:微波功率357 W,提取時間63 min,料液比1∶26 g/mL,提取溫度47 ℃,總黃酮的提取量為14.59 mg/g,并得到影響提取量主要因素變量的二次多元回歸模型,該模型的回歸極為顯著,對實驗擬和性好。

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Study on the microwave extraction technology of flavonoids from Exochorda racemosa and the antioxidant evaluation

ZHU Ling-ling,ZHANG Guang-wen*,YANG Ting-ting,QIU Rui-xia

(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Exochorda racemosa;microwave extraction;flavonoids;response surface methodology;Antioxidant activity

2015-05-13

朱玲玲(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品添加劑，E-mail:jiningzhulingling@163.com。

*通訊作者:張廣文(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：食品添加劑，天然產物活性成分，E-mail:zgwzsu@163.com。

TS201.1

B

1002-0306(2015)23-0239-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.041