趙 萍,劉 冰，2,竹 軍,王 聰，丁毛毛

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutellasinensis)菌絲體發(fā)酵液免疫活性的研究

趙 萍1,劉 冰1，2,竹 軍1,王 聰1，丁毛毛1

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

對蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液(HSFL)制劑進(jìn)行體內(nèi)和體外免疫活性研究。結(jié)果表明:該制劑在體外對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力顯著增加,并且在體外顯著提高了小鼠脾臟中NK細(xì)胞的活性;在體內(nèi)實驗中,該制劑可以顯著改善DNFB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng);顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液制劑具有調(diào)節(jié)免疫的生物活性。

菌絲體,發(fā)酵液制劑,免疫活性

冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berkeley)Saccardo.是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,主要產(chǎn)于我國,分布在西藏、青海、四川、云南等地。冬蟲夏草是菌蟲復(fù)合體,即蝙蝠蛾幼蟲軀體上的一種子囊真菌[1]。冬蟲夏草主要功效成分為蟲草酸(D-甘露醇)、蟲草素(3-脫氧腺苷)及抗菌活性物質(zhì)、麥角甾醇、多肽和氨基酸、多種維生素等[2]。

蟲草菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵在蟲草菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物的獲得上大大緩解了蟲草自然資源的破壞[3]。嚴(yán)林[4]首次報道了冬蟲夏草的寄主之一——青海拉脊蝙蛾(Hepialus lagii Yan)幼蟲頭、胸、腹各部分的形態(tài)特征。目前,國家批準(zhǔn)應(yīng)用蝙蝠蛾擬青霉菌(Paecilomyces hepiali)和蝙蝠蛾被毛孢菌(Hirsutella sinensis)發(fā)酵產(chǎn)物作為人工發(fā)酵的蟲草菌絲體。蝙蝠蛾被毛孢蟲草菌絲體粉對大、小鼠急性毒性屬于無毒級[5]。冬蟲夏草及蟲草菌絲體對肝臟、腎臟、心臟、免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖水平的作用[6-12],還具有改善睡眠的作用[13]。

以青海地區(qū)蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液(HSFL,fermented liquor of mycelium of Hirsutella sinensis)為研究對象,對其基本組成研究分析發(fā)現(xiàn),其中蟲草多糖和蟲草素含量較高,也含有一些氨基酸和微量元素。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵在獲得蟲草菌絲體的同時,也得到了大量的菌絲體發(fā)酵液。鑒于HSFL含有的活性成分和高產(chǎn)量,HSFL可以作為保健食品的很好來源[14]。本實驗將蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液配制成HSFL制劑,對該制劑進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)功能的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液 青海珠峰蟲草藥業(yè)有限公司;昆明種清潔級小鼠 160只,雌性,體質(zhì)量為18～22 g,蘭州大學(xué)動物實驗中心(許可證號:SCXK(甘)2009-0004);YAC-1細(xì)胞株 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院;刀豆蛋白A(ConA) 美國Sigma公司產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基 Hyclone公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清 四季青公司產(chǎn)品;吉姆薩染液試劑盒 南京建成公司產(chǎn)品;2,4-二硝基氟苯(DNFB) 使用前稱取50 mg,溶解于5 mL的丙酮麻油溶液中(丙酮∶麻油=1∶1)待用;酶標(biāo)儀 Elx808 Bio Tek;二氧化碳培養(yǎng)箱 CB210 Binder。

1.2 HSFL制劑的配制

蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液60 ℃減壓濃縮,抽濾、靜置過夜去除沉淀,用苯酚-硫酸法測定的多糖含量,使?jié)饪s液中多糖含量達(dá)到≥15 mg/mL,保證HSFL制劑具有增強(qiáng)免疫力的生物活性。濃縮去雜后的HSFL按比例加入甜味劑紐甜,得到HSFL制劑。

使用時,高劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至50 mL,混勻;中劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至100 mL,混勻;低劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至150 mL,混勻。

1.3 HSFL制劑體外免疫活性實驗

1.3.1 ConA誘導(dǎo)的體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 參考文獻(xiàn)[15-18],常規(guī)制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液,活細(xì)胞數(shù)>95%,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/mL。將脾細(xì)胞懸液加入24 孔培養(yǎng)板中1 mL/孔,再加入ConA液1 mL/孔,空白組加雙蒸水1 mL/孔,實驗組分別加入不同稀釋度HSFL制劑1 mL/孔。置于5% CO2、37 ℃孵箱中孵育68 h。之后離心,棄上清,加入MTT 50 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打均勻,分裝到96 孔培養(yǎng)板中,每個孔設(shè)置三個平行孔。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定光密度值。加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值,代表小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.3.2 小鼠體外NK細(xì)胞活性測定實驗 參考文獻(xiàn)[19-21],將YAC-1傳代培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/mL。制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液,完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度3×106/mL。96 孔培養(yǎng)板中加入YAC-1細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液各100 μL,自然釋放孔加培養(yǎng)液100 μL,最大釋放孔加1% NP40 100 μL。實驗組加不同稀釋度HSFL制劑各100 μL,每組設(shè)置三個平行孔,于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,之后離心,棄上清液,加入LDH基質(zhì)液,反應(yīng)10 min,每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL,在酶標(biāo)儀490 nm處測定光密度值。按下述方法計算NK細(xì)胞活性。

NK細(xì)胞活性(%)=(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100

1.4 HSFL制劑體內(nèi)免疫活性實驗

將實驗動物分為三大組,分別為免疫一組(體質(zhì)量增重、臟器/體質(zhì)量比值實驗)、免疫二組(二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))、免疫三組(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗),每大組隨機(jī)分配40 只實驗動物,按每千克體質(zhì)量的實驗劑量分為4個小組,分別為:對照組(0 mg/kg),低劑量組(25 mg/kg),中劑量組(50 mg/kg),高劑量組(100 mg/kg),對照組用生理鹽水。按照以上分組和劑量,連續(xù)灌胃30 d。

1.4.1 體質(zhì)量增重、臟器/體質(zhì)量比值實驗 末次稱重后,頸椎脫臼處死小鼠并解剖,取出脾臟、肝臟和胸腺并稱量,計算臟器和體質(zhì)量間的比值。

1.4.2 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH) 每只小鼠腹部脫毛,用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后,用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)。24 h后頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼,用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重。小鼠左右兩耳質(zhì)量之差表示DTH程度。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗 每只小鼠腹腔注射20%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL,間隔30 min處死小鼠,腹腔注射2 mL生理鹽水,吸出腹腔洗液0.5 mL,滴于預(yù)先處理過的載玻片的瓊脂圈內(nèi),37 ℃孵育30 min后,迅速用生理鹽水沖洗,4%的吉姆薩溶液染色3 min,蒸餾水沖洗晾干。顯微鏡下計數(shù),計算吞噬指數(shù)和吞噬百分率。

吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSFL制劑在體外對免疫活性的影響

2.1.1 HSFL制劑對ConA誘導(dǎo)的體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的影響 通過人為添加抗原(ConA),使之侵入機(jī)體,通過觀察淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力來判斷細(xì)胞免疫的強(qiáng)弱。高濃度的HSFL制劑對T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生影響,而ConA刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的增殖細(xì)胞中的線粒體水解酶活力也受到影響,從而使得光密度差值增大,顯示出調(diào)節(jié)免疫的作用。表1結(jié)果顯示,中劑量組和高劑量組與對照組比較有顯著性差異(p<0.05),低劑量組與對照組比較無顯著性差異(p>0.05)。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003)》中“細(xì)胞免疫功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性”,可判定HSFL制劑對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果為陽性。

表1 HSFL制劑對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

注:*表示與對照組比較p<0.05；光密度差值=OD加ConA孔-OD不加ConA孔。

2.1.2 HSFL制劑對小鼠體外NK細(xì)胞活性的影響 NK細(xì)胞是區(qū)別于T、B淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群,主要存在于外周血、脾臟、骨髓及淋巴結(jié)中,因此可以通過測定機(jī)體脾臟中NK細(xì)胞的活性來反映機(jī)體的免疫功能。表2結(jié)果顯示,中劑量組和高劑量組與對照組比較有顯著性差異(p<0.05),低劑量組與對照組比較無顯著性差異(p>0.05),根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003)》中“NK細(xì)胞活性測定實驗的一個以上劑量組結(jié)果陽性”,可判定HSFL制劑對NK細(xì)胞活性實驗結(jié)果為陽性。

表2 HSFL制劑對NK細(xì)胞活性的影響

注:*表示與對照組比較p<0.05，表3～表5同。

2.2 HSFL制劑在體內(nèi)對免疫活性的影響

2.2.1 HSFL制劑對小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的影響 胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,與細(xì)胞免疫、體液免疫相關(guān),當(dāng)機(jī)體接受外界免疫調(diào)節(jié)劑時,會使胸腺和脾臟的重量發(fā)生變化,因此測量其重量可作為判斷機(jī)體免疫功能的輔助指標(biāo)。如表3所示,與空白對照組相比,中、高劑量組肝臟系數(shù)顯著增加(p<0.05);低劑量組無顯著性差異(p>0.05);低、中、高劑量組脾臟系數(shù)顯著增加(p<0.05);低、中、高劑量組胸腺系數(shù)無顯著差異(p>0.05)。而與低劑量組相比,中、高劑量組的HSFL制劑能提高小鼠肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)。

表3 HSFL制劑對小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的影響

2.2.2 HSFL制劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響 T淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原活化后,合成并分泌細(xì)胞因子,其中,細(xì)胞因子IL-2、TNF-β等使得吞噬細(xì)胞活化,引起以單核-巨噬細(xì)胞為主的遲發(fā)型超敏反應(yīng);細(xì)胞因子IFN-γ介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫;效應(yīng)T細(xì)胞與同一抗原再次結(jié)合后刺激B細(xì)胞增殖分化,從而介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫。因此,測定T淋巴細(xì)胞活性可以用來判定機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。表4結(jié)果顯示,低劑量、中劑量、高劑量的HSFL制劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響差異顯著(p<0.05),根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003)》中“細(xì)胞免疫功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性”,可判定HSFL制劑對DNFB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果為陽性。

表4 HSFL制劑對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

2.2.3 HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響 單核-巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體非特異性免疫防御的重要細(xì)胞,具有吞噬及殺傷能力,它的功能強(qiáng)弱可以反映機(jī)體非特異性免疫功能的強(qiáng)弱。表5結(jié)果顯示低劑量HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響差異不顯著(p>0.05),而中、高劑量對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響差異顯著(p<0.05),說明一定劑量的HSFL制劑能夠提高機(jī)體的抗異物能力,從而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003)》中“單核-巨噬細(xì)胞功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性”,可判定HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗結(jié)果為陽性。

表5 HSFL制劑對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

3 結(jié)論

根據(jù)上述實驗,HSFL制劑在體外免疫活性實驗的結(jié)論為:HSFL制劑對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果為陽性,對NK細(xì)胞活性實驗結(jié)果為陽性。HSFL制劑在體內(nèi)免疫活性實驗的結(jié)論為:HSFL制劑對DNFB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果為陽性,對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗結(jié)果為陽性。

根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003)》[22]對保健食品評價結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)“在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個方面任兩個方面結(jié)果陽性,可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用”,可判定:HSFL制劑在體外具有免疫力調(diào)節(jié)功能,HSFL制劑在體內(nèi)具有免疫力調(diào)節(jié)功能。最終表明,蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發(fā)酵液制劑具有調(diào)節(jié)免疫的生物活性。

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Evaluation of immune function of fermented liquor of mycelium ofHirsutellasinensis

ZHAO Ping1,LIU Bing1,2,ZHU Jun1,WANG Cong1,DING Mao-mao1

(1. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China;2.Institute of Bbiological and Food Engineering of Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The purpose of this paper was to prove immune biological activity of preparation prepared by the fermented liquor of mycelium ofHirsutellasinensis(HSFL)invitroandinvivo. The preparation of HSFL could significantly influence both proliferation of ConA-induced spleen lymphocytes and activity of natural killer cellinvitro. Delayed-type hypersensitivity(DTH)and phagocytosis function of mononuclear-macrophage in high-dose and intermediate-dose of preparation of HSFL were significantly enhancedinvivo. These data indicated that the preparation of HSFL had immunomodulatory activity.

mycelium ofHirsutellasinensis;the preparation of fermented liquor;immunomodulatory activity

2015-04-09

趙萍(1964-),女,碩士,教授,主要從事食品科學(xué)、農(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用方面的研究，E-mail:pingzhaogdqg@lut.cn。

甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃(0803RJZA044)。

TS201.4

B

1002-0306(2015)23-0363-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.067