杜 婷，王 鈺，陳量量，成采虹，李 艷，陳可泉

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816)

蔗糖合酶(EC2.4.1.13，sucrose synthase，SuSy)是植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。該酶可催化蔗糖和UDP(二磷酸尿核苷)生成果糖和UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)的可逆反應(yīng)，但目前研究認(rèn)為該酶偏向于蔗糖裂解反應(yīng)方向［1－3］。SuSy的活性可被己糖抑制并造成裂解反應(yīng)的中止［4］。反應(yīng)生成的UDPG是一種重要的尿苷二磷酸單糖，可在UDP糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的葡萄糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中作為輔底物提供活化的葡萄糖基［5］。利用蔗糖合酶與糖基轉(zhuǎn)移酶的偶聯(lián)可使反應(yīng)體系中的UDPG循環(huán)再生［6－8］。實(shí)驗(yàn)室前期研究的甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1能特異性催化甜菊糖中含量高并且具有較強(qiáng)后苦味的ST甙(甜菊糖甙)生成高甜度的RA甙(萊鮑迪甙A)［9］，其催化反應(yīng)由UDPG提供葡萄糖基。采用全細(xì)胞催化技術(shù)，通過外加葡萄糖生成胞內(nèi)UDPG，可避免添加昂貴的UDPG作為反應(yīng)底物［10］，但涉及ST甙和RA甙進(jìn)出細(xì)胞的問題，影響了催化效率。本研究中采用基于蔗糖合酶再生UDPG的雙酶體系催化ST甙合成RA甙(圖1)。先采用兩步PCR合成蔗糖合酶AtSUS1的編碼基因，然后構(gòu)建其與糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1共表達(dá)的重組菌。采用重組菌制備粗酶液進(jìn)行催化反應(yīng)，并考察了UDP起始濃度、pH、溫度，以及反應(yīng)時(shí)間的影響。這一工作為建立高效、經(jīng)濟(jì)合成RA甙的酶催化工藝奠定了基礎(chǔ)。

圖1 基于蔗糖合酶的UDPG再生系統(tǒng)Fig.1 Cyclic utilizationof UDPG based on sucrose synthase

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用基因和引物 由南京金斯瑞公司合成;CloneEZ PCR Cloning Kit購自南京金斯瑞公司;Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶和2000、15000 DNA Marker 購自Takara公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA片段純化與膠回收試劑盒 購于上海申能博彩有限公司;ST甙和RA甙 購自曲阜海根甜菊制品有限公司。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92－IIN 購于寧波新芝生物科技股份有限公司;高速冷凍離心機(jī)eppendorf 5810R;ST甙和RA甙濃度測定采用安捷倫1290液相色譜系統(tǒng)和無錫加萊克色譜科技有限公司的NH2柱(4.6 ×250 mm，5 μm 120 ?)。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株E.coli Rosetta(DE3)和載體pET－22b(+)為本實(shí)驗(yàn)室保藏;載體pMDTM－18T 購自TaKaRa公司;質(zhì)粒pET28a－UGT為本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的在pET－28a(+)質(zhì)粒的Nde I和Xho I位點(diǎn)間插入U(xiǎn)GT76G1糖基轉(zhuǎn)移基因的重組質(zhì)粒。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L;自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(修改的TB培養(yǎng)基［11］):酵母提取物 24 g/L，胰蛋白胨 12 g/L，甘油5 g/L，磷酸氫二鉀12.5 g/L，磷酸二氫鉀2.3 g/L，葡萄糖2 g/L，乳糖3 g/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蔗糖合酶AtSUS1的基因合成 檢索National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)已公布的擬南芥蔗糖合酶的基因序列(NM_122090)，采用 DNAWorks［12］設(shè)計(jì) 72 條寡核苷酸引物，采用兩步法合成基因［13］，如圖2所示。

第一步:將72條引物分為四組，每組18條引物等量混合作為模板，兩端的兩條寡核苷酸作為引物，先合成四個(gè)600 bp左右的小片段。PCR采用Primer STAR HS DNA Polymerase(TAKARA)在 50 μL 體系中進(jìn)行。反應(yīng)條件為:98℃變性10 s，68℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)。

第二步:重疊PCR。將第一部中合成的四個(gè)小片段等量混合作為模板，采用第1條和第72條寡核苷酸引物進(jìn)行重疊PCR合成大小為2.4 kb的大片段AtSUS1基因。PCR在50 μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為:98℃變性10 s，68℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)。

合成的基因用TAKARA公司的DNA產(chǎn)物膠回收試劑盒純化。對純化回收后的基因片段用Nde I和Xho I酶切，對質(zhì)粒pET－22b(+)采用相同的酶進(jìn)行雙酶切處理，將以上處理完的表達(dá)載體和AtSUS1基因采用T4 DNA Ligase進(jìn)行16℃過夜連接，次日轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中涂布于氨芐平板(含氨芐青霉素100 μg/mL)并挑取單克隆，重組質(zhì)粒為pET22b－SUS，對抽提質(zhì)粒采用Nde I和Xho I雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒測序工作由南京金斯瑞完成。

圖2 兩步PCR法合成基因AtSUS1Fig.2 Gene synthesis of AtSUS1 by two－step PCR

1.4.2 雙基因表達(dá)質(zhì)粒 pEUGT－SUS的重組構(gòu)建 采用CloneEZ?試劑盒將AtSUS1基因亞克隆到質(zhì)粒pEUGT，得到新的重組質(zhì)粒pEUGT－SUS，將其轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta(DE3)中，得到含雙酶基因的重組菌E.coli Rosetta(pEUGT－SUS)。構(gòu)建過程示意圖如圖3。

以上述pET22b－SUS質(zhì)粒為模板，用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到基因AtSUS1。

劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)，用相同的酶對質(zhì)粒pET28a－UGT進(jìn)行酶切得到線性化載體，用CloneEZ?試劑盒將PCR產(chǎn)物與線性載體進(jìn)行重組。重組體系為 20 μL:線性化載體 6 μL，PCR 產(chǎn)物 6 μL，10 ×CloneEZ buffer 2 μL，CloneEZ Enzyme 2 μL，去離子水4 μL。得到的表達(dá)質(zhì)粒 pEUGT－SUS導(dǎo)入 E.coli Rosseta(DE3)。

圖3 表達(dá)質(zhì)粒pEUGT－SUS構(gòu)建過程示意圖Fig.3 Construction of recombinant plasmid pEUGT－SUS

1.4.3 pEUGT－SUS重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取重組菌E.coli Rosetta(pEUGT－SUS)單菌落和含pET－28a(+)的對照菌單菌落至5 mL含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min培養(yǎng)12 h。然后按2%接種量分別接種到帶相應(yīng)抗性的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基［14］中，37℃培養(yǎng)2 h，轉(zhuǎn)30℃培養(yǎng)10 h誘導(dǎo)表達(dá)。4℃ 8000 r/min離心10 min收集菌體，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)懸浮洗滌兩次。用同樣的磷酸鉀緩沖液充分重懸裂解菌體，然后進(jìn)行超聲破碎(功率300 W，超聲3 s，間歇5 s，共進(jìn)行10 min)。破碎結(jié)束后，4℃ 8000 r/min離心20 min，所得上清液即粗酶液。

1.4.4 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定 在5 mL的反應(yīng)體系中 (ST 甙 1mmol/L、UDPG2mmol/L、MgCl21.5 mmol/L、pH7.2)，加入1.4.3中的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，35℃反應(yīng)1 h。高溫95℃加熱5 min終止反應(yīng)，12000 r/min，離心1 min收集上清，然后用高效液相色譜(HPLC)分析RA甙濃度。酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化形成1 μmol RA甙所需要的酶量為1個(gè)活力單位(U)。

1.4.5 酶催化反應(yīng)體系 取1.4.3小節(jié)中制備的粗酶液，轉(zhuǎn)移至小三角瓶中，10 mL反應(yīng)體系中包括以下物質(zhì):ST甙10 g/L、蔗糖10 g/L、粗酶液 82.3 mU/mL、UDP 0.001 mmol/L、MgCl21.5 mmol/L、CaCl210 mmol/L、磷酸鉀緩沖液 0.1 mol/L，pH7.2，35 ℃，反應(yīng)12 h取樣。高溫95℃加熱5 min終止反應(yīng)，12000 r/min，離心1 min收集上清，將上清液稀釋10倍，然后用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析。

主要考察了UDP起始濃度、pH、溫度以及反應(yīng)時(shí)間對酶催化反應(yīng)的影響。在其他條件不變的情況下，分別改變這四個(gè)因素。UDP的起始濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、0.5、1.0 mmol/L;反應(yīng)的 pH 分別為6.4、6.8、7.2、7.6、8.0;反應(yīng)溫度分別為 25、30、35、37、40 和 45 ℃;反應(yīng)時(shí)間分別為 3、6、9、12、16、20、24、30、36 和48 h。

1.4.6 RA甙測定 色譜柱:Lichrospher NH2柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙睛∶水(80∶20，V∶V)，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.56;流速:1 mL/min;柱溫:40℃;檢測波長:210 nm［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtSUS1基因的合成

采用兩步PCR法合成，第一步先合成四個(gè)600 bp左右的小片段，以此為模板進(jìn)行第二步重疊PCR，合成2.4 kb左右的大片段。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖4所示。可知，PCR產(chǎn)物有明顯的特異條帶(泳道2～4為平行制備的三份樣品)，對應(yīng)片段大小與預(yù)期結(jié)果相符合。

圖4 AtSUS1基因的PCR電泳圖Fig.4 PCR of AtSUS1

回收上述基因片段，采用Nde I和Xho I酶切之后與同樣處理的pET－22b(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α中經(jīng)氨芐平板篩選后，對獲得的陽性克隆提取質(zhì)粒用Nde I和Xho I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示。在2.4 kb和5.5 kb處出現(xiàn)兩條清晰條帶，分別為目的基因與載體片段對應(yīng)的大小，說明目的基因已成功連接到質(zhì)粒pET－22b(+)。通過測序進(jìn)一步確認(rèn)目的基因已正確合成，該重組質(zhì)粒命名為pET22b－SUS。

圖5 pET22b－SUS酶切鑒定Fig.5 Enzyme digestion of pET22b－SUS

基因合成技術(shù)通過優(yōu)化密碼子和基因修飾為增強(qiáng)異源蛋白表達(dá)提供了最有力的工具。本研究中采用了二步PCR法合成了長約2.4 kb的基因片段，在第一步PCR中無需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，其產(chǎn)物直接作為第二步PCR的模板;采用Primer STAR HS DNA Polymerase(TAKARA)在每輪PCR中只需設(shè)計(jì)兩步不同溫度循環(huán);在引物設(shè)計(jì)時(shí)將酶切位點(diǎn)帶入基因兩端的引物中，獲得的目的片段可經(jīng)酶切后一步克隆到表達(dá)載體上。因此，該方法具有便捷、快速的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 表達(dá)質(zhì)粒pEUGT－SUS 的鑒定

用CloneEZ?試劑盒將AtSUS1基因亞克隆到pET28a－UGT質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行Nde I和Xho I雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳在2.4、1.4 kb處出現(xiàn)兩條清晰條帶，分別對應(yīng)AtSUS1和UGT76G1編碼基因的大小，如圖6所示。結(jié)果表明目的基因已成功構(gòu)建到 pET28a－UGT中，所得質(zhì)粒命名為pEUGT－SUS。

圖6 pEUGT－SUS酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion of pEUGT－SUS

2.3 雙酶催化反應(yīng)

為了測試蔗糖合酶AtSUS1和UDP糖基轉(zhuǎn)移酶共表達(dá)效果，將重組菌E.coli Rosetta(pEUGT－SUS)表達(dá)后制備的粗酶液用于催化反應(yīng)。分別考察了UDP起始濃度、pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間對酶法合成RA甙的影響。

UGT76G1催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，需要UDPG作為活化的糖基供體，而UDPG極其昂貴。蔗糖合酶AtSUS1能將蔗糖與UDP催化生成果糖和UDPG。通過共表達(dá)這兩個(gè)酶將兩個(gè)反應(yīng)偶聯(lián)，該反應(yīng)體系只需要添加少量相對廉價(jià)的UDP就可起始反應(yīng)，通過蔗糖合酶實(shí)現(xiàn)UDPG的再生。分別考察了不同的UDP起始濃度對酶催化合成RA甙的影響，結(jié)果如圖7所示。UDP濃度為0～0.01 mmol/L時(shí)，隨著 UDP濃度上升，RA甙產(chǎn)量增加;而在此后UDP濃度為0.01～0.5 mmol時(shí)，RA甙產(chǎn)量下降，之后幾乎保持不變。在0.01 mmol/L的UDP濃度條件下，10 g/L ST甙轉(zhuǎn)化生成6.73 g/L RA甙，對應(yīng)RA甙收率為56.2%。

圖7 不同UDP濃度對RA甙產(chǎn)量的影響Fig.7 The influence of different UDP concentration on the yield of RA

分別考察了不同pH緩沖液對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖8所示，在pH低于7.2時(shí)，RA甙生成量較低，這可能是由于在酸性緩沖液中糖基轉(zhuǎn)移酶的活性較低，且蔗糖合酶反應(yīng)方向傾向UDPG分解所致［16］;當(dāng) pH 大于7.2時(shí)，RA 甙生成量減少，這可能是由于堿性溶液中Mg2+易沉淀，從而影響酶活性。因此，本反應(yīng)中緩沖液的最佳pH為7.2。

圖8 不同pH對RA甙產(chǎn)量的影響Fig.8 The influence of different pH on the yield of RA

分別考察了不同的反應(yīng)溫度對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖9所示，當(dāng)催化反應(yīng)溫度小于40℃時(shí)，RA甙生成量隨著溫度的升高而增加，說明在25～40℃溫度范圍內(nèi)，提高溫度對RA甙量有一定促進(jìn)作用。這可能是溫度的提高，有利于提高糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合酶AtSUS1的活性。在40～45℃，RA甙量逐步減少，說明較高溫度會(huì)影響兩個(gè)酶的活性。在40℃時(shí)，RA甙的濃度最高，為2.36 mg/mL，因此，本反應(yīng)中最佳溫度為40℃。這一溫度也是重組糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的最適反應(yīng)溫度［9］。

分別考察了不同的反應(yīng)時(shí)間對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖10所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于16 h時(shí)，RA甙生成量隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加，說明在0～16 h范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，RA甙的量一直在積累。16 h以后，RA甙濃度開始下降，可能是由于產(chǎn)物RA甙存在一定的降解。在16 h時(shí)，RA甙的量達(dá)到最高，為6.39 mg/mL，因此，本反應(yīng)中最佳催化反應(yīng)時(shí)間以16 h。

圖9 不同溫度對RA甙產(chǎn)量的影響Fig.9 The influence of different temperature on the yield of RA

圖10 不同反應(yīng)時(shí)間對RA甙產(chǎn)量的影響Fig.10 The influence of different time on the yield of RA

3 結(jié)論與討論

本研究中糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合酶基因均屬植物來源，盡管選用了攜帶稀有密碼子表達(dá)質(zhì)粒的E.coli Rosetta(DE3)作為宿主菌，但重組酶大部分依然以包涵體形式存在，因此，后續(xù)考慮采用融合標(biāo)簽來增加重組酶的可溶表達(dá)。本研究的實(shí)驗(yàn)條件下UDP濃度、反應(yīng)pH、及溫度等對催化產(chǎn)物合成的影響，是對反應(yīng)體系中的兩種酶的影響的綜合體現(xiàn)，對糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分別表征有利于加深對雙酶系統(tǒng)的了解，進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化效率。

本研究構(gòu)建了共表達(dá)甜葉菊UGT糖基轉(zhuǎn)移酶和擬南芥AtSUS1蔗糖合酶的重組大腸桿菌E.coli Rosetta(pEUGT－SUS)，將重組菌粗酶液用于催化合成RA甙的研究中，初步建立了循環(huán)利用UDPG，催化ST甙合成RA甙的“一鍋雙酶”反應(yīng)體系，只需要添加相對廉價(jià)且遠(yuǎn)低于理論值用量的UDP為起始材料。這一策略有利于降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)酶法改質(zhì)甜菊糖甙的實(shí)際應(yīng)用。

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