郝魯江,范秋蘋,張曉飛,盧曉平,許艷蕊

(齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點實驗室,山東濟南 250353)

海洋細菌Pseudoalteromonasissachenkonii產(chǎn)胞外多糖EPS-PⅡ的發(fā)酵工藝優(yōu)化

郝魯江,范秋蘋,張曉飛,盧曉平,許艷蕊

(齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點實驗室,山東濟南 250353)

目的:本實驗對一株產(chǎn)胞外多糖EPS-PⅡ的海洋細菌Pseudoalteromonasissachenkonii的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。方法:采用單因素實驗,確定培養(yǎng)基組成,并采用Plackett-Burman聯(lián)用Box-Behnken設(shè)計確定最佳發(fā)酵條件。結(jié)果:實驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖,酵母浸膏和海鹽組成,發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間33.8 h,接種量8.8%,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min。結(jié)論:采用最優(yōu)發(fā)酵條件得出EPS-PⅡ最高產(chǎn)量可達2.62 g/L,比優(yōu)化前提高了116.5%。

海洋細菌,胞外多糖,單因素實驗,Plackett-Burman法,Box-Behnken法

近年來,海洋細菌多糖由于其結(jié)構(gòu)多樣性和理化性質(zhì)獨特在海洋生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)特別是藥學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[1-2]。據(jù)報道,海洋細菌多糖不僅具有吸濕保濕和抗氧化性,多應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)[3];而且在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血糖血脂等方面也顯示出特有的生物活性,使其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[4-5]。本實驗菌株是由皺紋盤鮑采苗板上分離得到的高產(chǎn)多糖海洋菌株,經(jīng)鑒定為Pseudoalteromonasissachenkonii(依氏假單胞菌),所產(chǎn)胞外多糖被命名為EPS-PⅡ,由Zobell 2216E培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵得其平均產(chǎn)量為1.21 g/L,經(jīng)實驗證明其在吸濕保濕,抗氧化性和吸附重金屬離子等方面具有重要功能,本文采用單因素實驗和Plackett-Burman聯(lián)用Box-Behnken設(shè)計對海洋細菌產(chǎn)EPS-PⅡ的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行研究,為EPS-PⅡ的進一步擴大發(fā)酵和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由皺紋盤鮑采苗板上分離得到的高產(chǎn)多糖海洋菌株,經(jīng)鑒定為Pseudoalteromonasissachenkonii(依氏假單胞菌);固體培養(yǎng)基 Zobell 2216E培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母膏1 g/L,海鹽35 g/L,瓊脂20 g/L,蒸餾水1 L,調(diào)pH至7.6～7.8;種子培養(yǎng)基 Zobell 2216E培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母膏1 g/L,海鹽35 g/L,蒸餾水1 L,調(diào)pH至7.6～7.8;濃硫酸、苯酚、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、尿素、硫酸銨、酵母浸粉、牛肉膏,95%乙醇 國產(chǎn)分析純。

恒溫震蕩培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 將生長良好的Pseudoalteromonasissachenkonii菌株斜面25 ℃靜置活化24 h后接種于50 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶),30 ℃、100 r/min搖床震蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將上述種子液以10%接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶),搖床震蕩培養(yǎng)。進行單因素實驗時的發(fā)酵條件為:30 ℃,150 r/min,48 h。

1.2.3 單因素實驗方法 碳源:選取不同種類碳源進行單因素實驗[6-8],碳源濃度為30 g/L,蛋白胨為5 g/L,海鹽為35 g/L,得到最佳碳源后對其不同濃度添加量進行實驗,得到最適碳源濃度;氮源:方法同上;海鹽濃度:培養(yǎng)基中添加不同濃度的海鹽,葡萄糖為30 g/L,蛋白胨為5 g/L。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,選取對EPS-PⅡ產(chǎn)量影響較大的因素,考察裝液量、培養(yǎng)時間、pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度,還包括培養(yǎng)基成分碳源,氮源和海鹽在內(nèi)的共9個因素的重要性。每個因素采用高、低兩個水平,篩選出影響EPS-P Ⅱ產(chǎn)量的顯著因素[9],具體設(shè)計方法見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素表

1.2.5 Box-Behnken實驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman實驗得到的顯著因素,進一步用Box-Behnken實驗設(shè)計,設(shè)計三個水平,采用Design-Expert 8.05b對數(shù)據(jù)進行整理分析并得到響應(yīng)面圖形[10-11],具體設(shè)計方法見表2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計因素表

1.2.6 多糖產(chǎn)量測定方法 苯酚-硫酸法[12]

1.2.7 苯酚硫酸法繪制葡萄糖標準曲線 準確稱取標準葡萄糖20 mg定容至500 mL容量瓶中,加水定容。分別吸取0,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8 mL葡萄糖溶液,各補水至2.0 mL,然后分別加入1 mL 6%苯酚及5 mL濃硫酸,靜置10 min,搖勻,室溫放置20 min,以490 nm處測吸光度,以2.0 mL水按同樣顯色操作做為空白,以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線[12]。

1.2.8 EPS-PⅡ多糖產(chǎn)量測定 發(fā)酵液離心去菌體(5000 r/min,20 min),收集上清液并加入4倍體積95%乙醇,充分震蕩,4 ℃靜置過夜,離心收集沉淀(5000 r/min,20 min)[13-14]。將沉淀用水稀釋至適宜濃度,取1 mL,按1.2.6方法測定發(fā)酵液中總糖含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel表格對單因素實驗結(jié)果作圖,得到發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組成,并采用Design-Expert 8.05b對Plackett-Burman和Box-Behnken實驗數(shù)據(jù)進行整理分析,篩選出影響EPS-P Ⅱ產(chǎn)量的顯著因素,并得到響應(yīng)面圖形[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法繪制得到葡萄糖標準曲線

根據(jù)1.2.6方法測得標準曲線,如圖1,方程為:y=0.0050x-0.0013,R2=0.9912,擬合度良好。

圖1 苯酚-硫酸法標準曲線Fig.1 Standard curve of Phenol sulfuric acid method

2.2 單因素實驗確定培養(yǎng)基組成

2.2.1 碳源對EPS-P Ⅱ產(chǎn)量的影響 以多糖EPS-P Ⅱ的產(chǎn)量為標準依據(jù),結(jié)果如圖2和圖3,表明該菌能利用多種碳源,在以葡萄糖為碳源時,EPS-PⅡ產(chǎn)量最高,并得到最適葡萄糖濃度為30 g/L。

圖2 不同碳源對多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 The influence of different carbon sources on polysaccharide yield

圖3 葡萄糖濃度對多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 The influence of Glucose levels on polysaccharide yield

2.2.2 氮源對EPS-PⅡ產(chǎn)量的影響 結(jié)果如圖4和圖5,表明該菌株均能利用無機和有機氮源,在以酵母浸膏為氮源時,EPS-PⅡ產(chǎn)量最高,且最適酵母浸膏濃度為4.5 g/L。

圖4 不同氮源對多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 The influence of different nitrogen sources on polysaccharide yield

圖5 酵母浸膏含量對多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of Yeast extract levels on polysaccharide yield

2.2.3 海鹽濃度對EPS-PⅡ產(chǎn)量的影響 結(jié)果如圖6,發(fā)現(xiàn)海鹽濃度為35 g/L時,EPS-PⅡ產(chǎn)量最高,海鹽濃度升高EPS-PⅡ產(chǎn)量反而出現(xiàn)下降,可能由于海鹽濃度升高抑制了菌體生長。

圖6 海鹽含量對多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 The influence of Baysalt levels on polysaccharide yield

2.3 Plackett-Burman設(shè)計篩選影響EPS-PⅡ產(chǎn)量的顯著因素

Plackett-Burman設(shè)計實驗結(jié)果見表3。使用Design expert 8.05b軟件對各因素進行顯著性分析,見表4和表5,p<0.05表示差異有顯著性。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果

表4 顯著性分析

表5 顯著性分析結(jié)果

由表4各因素對多糖產(chǎn)量的貢獻值可以看出，各因素對多糖產(chǎn)量影響的大小順序為： F>J>K>C>G>A>L>E>B，由表5可知，模型的p<0.05，F(xiàn)、J、K的p值均小于0.05，表明F、J、K對多糖影響顯著，且影響順序為：F(培養(yǎng)時間)>J(接種量)>K(搖床轉(zhuǎn)速)。A、B、C、E、G、L對EPS-PⅡ產(chǎn)量未見顯著影響，根據(jù)單因素試驗和預(yù)實驗得到的各因素最優(yōu)水平，作為EPS-PⅡ發(fā)酵的最終培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，即葡萄糖30 g/L，酵母浸膏4.5 g/L，海鹽35 g/L，裝液量為40%，pH8，溫度選擇25 ℃。

表7 響應(yīng)面實驗方差分析表

注:p<0.05時顯著,p<0.001時極顯著。

2.4 Box-Behnken實驗設(shè)計確定最終發(fā)酵條件

根據(jù)Plackett-Burman實驗得到的三個顯著因素,進一步用Box-Behnken實驗設(shè)計,確定各因素的最優(yōu)水平,表6為實驗結(jié)果,采用Design-Expert 8.05b對表6數(shù)據(jù)進行整理分析,得到響應(yīng)面實驗方差分析表,見表7。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果

圖7 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots showing the effects of any two factors on the yield of EPS-PⅡ

采用Design-Expert 8.05b對表6數(shù)據(jù)進行多元擬合,得到擬合方程:多糖產(chǎn)量=2.75+1.007E-003X1+0.065X2+7.058E-003X3-0.11X1X2+0.058X1X3-0.052X2X3-0.20X12-0.066X22-0.052X32。

根據(jù)多元回歸方程結(jié)果,構(gòu)建兩因素交互作用的響應(yīng)面圖(圖7),可以看出,X1X2、X1X3和X2X3交互影響極為顯著,X2曲線最陡,說明X2對EPS-PⅡ產(chǎn)量的影響最顯著,其次是X1和X3,這與表7的分析結(jié)果一致[16]。

由該軟件分析得到最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)時間33.78 h,接種量8.79%,搖床轉(zhuǎn)速171 r/min,EPS-P Ⅱ最高產(chǎn)量預(yù)測值為2.7836 g/L。

2.5 驗證實驗

為了實驗的可操作性,將發(fā)酵條件修改為培養(yǎng)時間33.8 h,接種量8.8%,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,采用該條件進行三次平行實驗,得到EPS-PⅡ產(chǎn)量平均值為2.62 g/L,預(yù)測值與真實值偏差為6.24%,兩者具有良好擬合性。

3 結(jié)論

本實驗采用單因素實驗對胞外多糖EPS-PⅡ的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,獲得培養(yǎng)基最佳配比為:30 g/L葡萄糖,4.5 g/L酵母浸膏,35 g/L海鹽;并采用Plackett-Burman聯(lián)用Box-Behnken設(shè)計確定了最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)時間33.8 h,接種量8.8%,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，裝液量40%，pH8,溫度25 ℃。經(jīng)最優(yōu)條件發(fā)酵后,EPS-PⅡ最高產(chǎn)量可達2.62 g/L,接近預(yù)測值,與優(yōu)化前平均產(chǎn)量1.21 g/L相比,提高了116.5%,說明了該實驗方法的有效性,為EPS-PⅡ的進一步擴大發(fā)酵和應(yīng)用提供了一定的參考數(shù)據(jù)。

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Optimization of fermentation conditions for exopolysaccharide EPS-PⅡby marine bacteriumPseudoalteromonasissachenkonii

HAO Lu-jiang,FAN Qiu-ping,ZHANG Xiao-fei,LU Xiao-ping,XU Yan-rui

(Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China)

Objective:To optimize the fermentation conditions of exopolysaccharide EPS-PⅡproduced byPseudoalteromonasissachenkonii.Method:The medium composition was determined by single factor experiment,Plackett-Burman combined with Box-Behnken was used to determine the optimum fermentation conditions.Results:The experiment showed that the fermentation medium was composed of glucose,yeast extract and baysalt,the fermentation conditions were 8.8% inoculum,170 r/min shaking speed and 33.8 h for fermentation.Conclusion:Under the optimum conditions,the yield of EPS-PⅡwas 2.62 g/L,which was increased by 116.5%.

marine bacterial;exopolysaccharide;single factor experiment;Plackett-Burman method;Box-Behnken method

2015-03-10

郝魯江(1972-)，男，博士研究生，副教授，研究方向：海洋細菌活性物質(zhì)的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化及結(jié)構(gòu)和功能，E-mail：lujiang_hao@163.com。

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012CM019)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)23-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.044