王忠合,王 軍,李珍妮,孫遠(yuǎn)明,柳春紅,賴長鴻

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510630;2.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院,廣東潮州 521041;3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,廣東廣州 510630)

超聲波處理對豌豆分離蛋白功能特性的影響

王忠合1,2,王 軍2,*,李珍妮2,孫遠(yuǎn)明1,柳春紅1,賴長鴻3

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510630;2.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院,廣東潮州 521041;3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,廣東廣州 510630)

以豌豆分離蛋白為原料,采用不同強(qiáng)度的超聲波處理,研究超聲波處理對豌豆分離蛋白溶解性、起泡性、乳化性、持水性、吸油性等功能特性的影響。結(jié)果表明,一定強(qiáng)度的超聲波處理范圍內(nèi),豌豆分離蛋白的溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性均隨著超聲波強(qiáng)度的提高而增大,當(dāng)超聲波強(qiáng)度超過69.36 W/cm2時(shí),豌豆分離蛋白的溶解度逐漸趨于平穩(wěn);豌豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化在超聲波強(qiáng)度分別為75.68 W/cm2和59.28 W/cm2后趨于穩(wěn)定。豌豆分離蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、持水性和吸油性隨著超聲波強(qiáng)度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在超聲波強(qiáng)度為69.36 W/cm2時(shí),起泡性和泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最高,持水性和吸油性則在超聲波強(qiáng)度分別為75.68、49.35 W/cm2時(shí)達(dá)到最高。上述分析表明,適度強(qiáng)度的超聲波處理可改善豌豆分離蛋白的功能特性。

超聲波,豌豆分離蛋白,功能性

豌豆(Pisum sativum L.)是重要的糧食作物之一,既可以作為糧食來食用,在其生長期間采摘也可作為蔬菜,營養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)含量占干豌豆的23%～25%,是一種比較理想的植物蛋白,其組成比較平衡,特別是賴氨酸的含量高達(dá)1.5%[1-2],并且含有豐富的維生素和礦物質(zhì)。豌豆蛋白是一種較好的必需氨基酸源,與FAO/WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式較為接近,富含賴氨酸,缺乏含硫氨基酸,并與其它的植物蛋白一樣,蛋氨酸和胱氨酸是限制氨基酸[3]。然而,由于豌豆蛋白溶解度低以及抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在,降低了其消化率和生物效價(jià),并大大限制了其應(yīng)用范圍,因此為了改善豌豆蛋白的營養(yǎng)性和生物利用率常采用發(fā)酵法或酶法將豌豆蛋白水解制備豌豆多肽[4]或采用糖基化法制備具有益生特性的糖蛋白[1]。

超聲波作為一種新型的非熱處理技術(shù),具有空化作用,對大分子可產(chǎn)生機(jī)械性斷鍵作用,可以強(qiáng)化提取過程和加速反應(yīng),且產(chǎn)生的氣泡經(jīng)擠壓破裂,可以在瞬間產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切力,改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和特性,從而影響蛋白的功能特性[5-6]。研究表明,(低頻)高場強(qiáng)超聲波是頻率介于16～100 kHz、功率介于10～1000 W/cm2之間,其能量較大,常用于食品工業(yè)中改善物料的特性、促進(jìn)反應(yīng)、輔助提取和超聲嫩化等領(lǐng)域[6-8]。蛋白質(zhì)的功能特性,如溶解性、起泡性和乳化性等,在提高食品品質(zhì)方面尤為重要,因而提高蛋白質(zhì)的功能特性是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一[9-10]。本文采用超聲波處理豌豆分離蛋白,研究其對豌豆分離蛋白功能特性的影響,以揭示超聲波技術(shù)在改善豌豆分離蛋白功能性方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆 當(dāng)?shù)厥袌?常溫保存?zhèn)溆?花生油 當(dāng)?shù)厥袌?亞硝基鐵氰化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS) 生工生物工程(上海)有限公司;牛血清白蛋白、硫酸銨、蔗糖、濃硫酸、硫酸銅、無水硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、水楊酸鈉、次氯酸鈉、磷酸等均為分析純。

JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHSJ-3F型pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;2-16P離心機(jī) 美國Sigma有限公司;IKA T18 basic高速分散器 德國ULTRA TURRAX公司;風(fēng)選中藥粉碎機(jī) 山東省青州市益康中藥機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆分離蛋白(PPI)的制備 將豌豆經(jīng)干燥、脫皮、粉碎,過80目篩,按照料液比1∶5加入正己烷脫脂制成脫脂豌豆粉。稱取100 g脫脂豌豆粉分散于500 mL去離子水中,用2.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0于40 ℃水浴中攪拌提取處理30 min。然后以4000 r/min離心10 min,沉淀物重復(fù)提取一次,合并上清液,用0.05 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.5進(jìn)行酸沉,再以4000 r/min離心10 min,收集沉淀,用蒸餾水清洗2～3次,用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH到7.0,然后進(jìn)行冷凍干燥24 h,得到豌豆分離蛋白[4]。采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法[11]測定其蛋白質(zhì)含量為:87.3%±1.2%。

1.2.2 超聲波處理 配制濃度為3%(w/v)的PPI溶液,置于超聲波細(xì)胞破碎儀中用直徑為0.6 cm的超聲波探頭插入溶液內(nèi)1～2 cm深度處理10 min,工作參數(shù)為:工作4 s、間歇2 s、最高溫度50 ℃,為減少熱效應(yīng)采用冰水浴進(jìn)行控溫。超聲波功率分別為0、100、200、300、400、500、600 W,處理后的樣品冷凍干燥,測定功能特性。

1.2.3 超聲強(qiáng)度的測定 采用量熱法測定超聲強(qiáng)度,將蛋白樣品溶液置于絕熱容器中于不同功率下處理,超聲過程中溫度的升高通過電子溫度計(jì)TASI 601記錄,根據(jù)溫度隨時(shí)間的變化曲線,用下式估算聲能的大小[5-6],方程如下:

式中,P是超聲功率,W;m是指超聲處理的溶液質(zhì)量,g;Cp為溶液的比容,J/(kg·K);dT/dt是指該曲線的斜率,K/s。

超聲強(qiáng)度的計(jì)算公式如下:

式中,UI是超聲強(qiáng)度,W/cm2;P是超聲功率,W;D是探針直徑,0.6 cm。

1.2.4 溶解度的測定 配制濃度為0.2 mg/mL的待測樣品溶液,用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.5 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH至7.0,在30 ℃水浴下攪拌30 min(攪拌過程中測定并保持pH),于3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法[11]測定上清液中蛋白質(zhì)的含量,根據(jù)總蛋白的含量計(jì)算蛋白質(zhì)的溶解性,結(jié)果表示為上清液中蛋白濃度占相應(yīng)的總蛋白濃度的百分比。

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定 配制3%的蛋白質(zhì)溶液,用0.5 mol/L的氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH至7.0,在30 ℃水浴下保溫10 min,然后用高速分散器在10000 r/min下均質(zhì)2 min,迅速倒入500 mL量筒中,記錄均質(zhì)停止時(shí)泡沫的體積V(mL),并記錄均質(zhì)停止后10 min的泡沫體積V10(mL),按照下式[12]計(jì)算起泡性FC和泡沫穩(wěn)定性FS:

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 采用經(jīng)典的比濁法[13]測定乳化特性。取1.8 mL 1 mg/mL待測樣品,溶于0.2 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液中,加入0.6 mL花生油,經(jīng)高速攪拌器于10000 r/min下處理1 min,分別在攪拌后0 min和10 min時(shí)從測試管底部取樣100 μL,用0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)稀釋50倍后,測定500 nm處吸光度值,以SDS溶液做空白。乳化性指數(shù)(EAI,m2/g)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI,min)的計(jì)算公式[13]如下:

式中:DF-稀釋倍數(shù),DF=100;C-為樣品濃度,g/mL;φ-光程,φ=1 cm;θ-乳液中油相所占比例,θ=0.25;A0-0 min時(shí)測定的吸光度;A10-10 min時(shí)測定的吸光度。

1.2.7 持水性的測定 準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品分散于20 mL蒸餾水中,80 ℃水浴保溫60 min后,用自來水冷卻至30 ℃,3000 r/min離心10 min,測出上清液的體積V(mL)。按照下式[14]計(jì)算持水性:

1.2.8 吸油性的測定 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于離心管中,加入色拉油10 mL混勻,靜置30 min,以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心25 min,測出游離油的體積V(mL)。按照下式[15]計(jì)算吸油性:

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行測定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲強(qiáng)度的測定結(jié)果

超聲能量是超聲波在機(jī)械作用過程中產(chǎn)生的能量,當(dāng)超聲波穿過介質(zhì)時(shí),這種能量會(huì)有部分以熱能的方式損失,使被超聲的液體發(fā)熱,依據(jù)溫度對時(shí)間的變化曲線可求得實(shí)際的超聲功率[16]。根據(jù)超聲強(qiáng)度的計(jì)算公式可求得20 kHz超聲波于不同功率下處理220 mL豌豆分離蛋白溶液的超聲強(qiáng)度,結(jié)果如表1所示。超聲輸出功率與超聲強(qiáng)度之間具有一定的相關(guān)性,且隨著超聲功率的增加超聲強(qiáng)度也逐漸增大,超聲處理過程中介質(zhì)的特性、處理容器的尺寸與形狀以及阻抗的匹配等因素均影響超聲波的有效功率,因而選擇超聲強(qiáng)度可以更準(zhǔn)確的表達(dá)超聲波處理的有效性。

表1 超聲功率與超聲強(qiáng)度的關(guān)系

注:同一行中數(shù)據(jù)右上角標(biāo)注不同的小寫字母表示差異顯著,p<0.05,表2同。

2.2 超聲強(qiáng)度對PPI溶解性的影響

溶解度是蛋白的重要功能特性之一,蛋白質(zhì)溶解度的大小在實(shí)際應(yīng)用中非常重要,如可用于評定蛋白質(zhì)的變性程度和聚集度等。超聲強(qiáng)度對PPI溶解性的影響如圖1所示。

圖1 超聲波強(qiáng)度對豌豆分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound intensity on solubility of PPI

當(dāng)超聲強(qiáng)度在0～85.36 W/cm2的范圍內(nèi),PPI的溶解度隨著超聲強(qiáng)度的增大而迅速增大,這可能是由于超聲波處理可引起蛋白質(zhì)變性,能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的次級鍵,使溶解度得到提高。同時(shí),超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)打開蛋白聚集體的同時(shí)打斷了蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu),形成溶于水的非共價(jià)鍵分子,與溶劑水的相互作用力加強(qiáng),使其溶解度增加[6]。當(dāng)超聲強(qiáng)度超過69.36 W/cm2時(shí),PPI溶解度的變化逐漸趨于平穩(wěn),這可能是由于超聲強(qiáng)度增大到一定程度,蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)受到破壞,使分子表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,原來藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露在分子表面,蛋白質(zhì)溶解度有所下降或趨于平穩(wěn)[17]。豌豆蛋白的其他修飾也可提高其溶解度,如美拉德反應(yīng)將糖基通過共價(jià)鍵連接而引入豌豆蛋白質(zhì)分子中,所連接的糖基分子中羥基的親水特性能夠顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性,但是由于糖基化修飾過程中的副產(chǎn)物影響安全性而限制了其應(yīng)用范圍[1]。然而,超聲波修飾豌豆蛋白屬于綠色加工技術(shù),產(chǎn)物的安全性高、應(yīng)用范圍廣。

2.3 超聲強(qiáng)度對PPI起泡特性的影響

由圖2可知,隨著超聲強(qiáng)度的增大,PPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當(dāng)超聲強(qiáng)度在69.36 W/cm2時(shí),豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大。原因可能是,其一,超聲波處理改變了PPI的表面疏水性,蛋白分子發(fā)生伸展,而適度伸展的蛋白分子間能形成更為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜,因而超聲處理后PPI的起泡性增強(qiáng)。其二,當(dāng)超聲強(qiáng)度逐漸增大時(shí),PPI的表面疏水性降低,這樣由蛋白分子間相互作用形成的穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜遭到破壞,產(chǎn)生的泡沫界面膜由于缺乏韌性而容易破裂,導(dǎo)致PPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性開始下降[18]。

圖2 超聲強(qiáng)度對豌豆分離蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of ultrasound intensity on foaming ability and foam stability of PPI

2.4 超聲強(qiáng)度對PPI乳化特性的影響

由表2可知,PPI的乳化性和乳化穩(wěn)定性均隨著超聲強(qiáng)度的增大而逐漸增加,乳化活性和乳化穩(wěn)定性在超聲強(qiáng)度分別達(dá)到75.68、59.28 W/cm2后其值趨于穩(wěn)定，但是在超聲強(qiáng)度超過75.68 W/cm2時(shí),PPI的乳化性和乳化穩(wěn)定性都有所降低,而乳化穩(wěn)定性在超聲強(qiáng)度超過59.28 W/cm2后其值趨于穩(wěn)定。這可能因?yàn)?其一,當(dāng)超聲強(qiáng)度增大時(shí),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性被破壞,造成空穴,蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)變得疏松,乳化能力和乳化穩(wěn)定性提高,且蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解度存在正相關(guān),當(dāng)超聲強(qiáng)度不斷增大,蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)造成大的破壞,蛋白質(zhì)變性增大,溶解度降低,乳化性能隨之降低。其二,蛋白質(zhì)的乳化性與其表面疏水性存在著正相關(guān)的關(guān)系,當(dāng)超聲強(qiáng)度逐漸增大至75.68 W/cm2時(shí),蛋白質(zhì)的表面疏水性開始增加,促使蛋白質(zhì)分子與水形成油-水界面膜,但是過高的超聲強(qiáng)度使得蛋白質(zhì)表面疏水性顯著降低,使蛋白質(zhì)分子與水不易形成油-水界面膜,從而使得蛋白質(zhì)乳化性能開始降低[19]。另外,采用中性蛋白酶法改性豌豆蛋白后乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯提高,但豌豆蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化,酶解形成了較多的小分子肽段[20]，因而超聲處理是一種較好的改善豌豆蛋白乳化特性的處理方法。

表2 超聲強(qiáng)度對豌豆分離蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

2.5 超聲強(qiáng)度對PPI持水性的影響

蛋白質(zhì)的持水性是指蛋白質(zhì)將水截留在其組織內(nèi)的能力。由圖3可知,超聲強(qiáng)度在0～75.68 W/cm2時(shí),PPI的持水性隨著超聲強(qiáng)度的增大而增大,但是超過75.68 W/cm2時(shí)持水性又開始降低,這可能是因?yàn)?超聲處理使蛋白分子發(fā)生伸展,將原來被掩蓋的一些肽鍵和極性基團(tuán)暴露于表面,提高了蛋白質(zhì)的水結(jié)合能力,但是隨著超聲強(qiáng)度的繼續(xù)增大,蛋白質(zhì)的變性增大,降低了蛋白質(zhì)的表面積和極性氨基酸與水結(jié)合的有效性,從而降低蛋白質(zhì)的持水性[14]。

圖3 超聲強(qiáng)度對豌豆分離蛋白持水性的影響Fig.3 Influence of ultrasound intensity on water binding ability of PPI

2.6 超聲強(qiáng)度對PPI吸油性的影響

蛋白質(zhì)的非極性區(qū)域和脂類的非極性脂肪族鏈間存在疏水作用,蛋白質(zhì)與甘油三酸酯形成脂-蛋白復(fù)合物,因而具有吸油性。由圖4可知,當(dāng)超聲強(qiáng)度小于49.35 W/cm2時(shí),PPI的吸油性隨著超聲強(qiáng)度的增大而增大,之后PPI的吸油性呈現(xiàn)下降的趨勢,這是因?yàn)槌曌饔檬沟玫鞍踪|(zhì)分子原有結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,變得疏松,將原來在分子內(nèi)部的一些非極性基團(tuán)暴露在分子表面,從而提高了蛋白質(zhì)分子的吸油性,但是,隨著超聲強(qiáng)度的增加,蛋白質(zhì)變性程度增大,使得蛋白質(zhì)分子的吸油性降低[21]。

圖4 超聲強(qiáng)度對豌豆分離蛋白吸油性的影響Fig.4 Influence of ultrasound intensity on oil absorbency of PPI

3 結(jié)論

在超聲波強(qiáng)度一定的范圍內(nèi),超聲波處理對PPI功能特性的影響有促進(jìn)作用。PPI的溶解度隨著超聲波強(qiáng)度的提高而增大,當(dāng)超聲強(qiáng)度超過69.36 W/cm2時(shí),溶解度的變化逐漸趨于平穩(wěn);起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨著超聲強(qiáng)度的增大而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,在超聲強(qiáng)度為69.36 W/cm2時(shí)達(dá)到最大;乳化性和乳化穩(wěn)定性均隨著超聲強(qiáng)度的增加而增大，當(dāng)超聲強(qiáng)度分別超過75.68、59.28 W/cm2時(shí)乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化趨于平緩的趨勢;持水性和吸油性則隨著超聲強(qiáng)度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,分別在75.68 W/cm2和49.35 W/cm2時(shí)達(dá)到最高。因此,適宜的超聲波處理可以改善豌豆分離蛋白的功能特性。

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Effect of ultrasound treatment on functional properties of pea protein isolate

WANG Zhong-he1,2,WANG Jun2,*,LI Zhen-ni1,SUN Yuan-ming1,LIU Chun-hong1,LAI Chang-hong3

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510630,China;2.College of Life Science and Food Technology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;3.College of Natural Resources and Enviroment,South China Agricultural University,Guangzhou 510630,China)

In this paper,pea protein isolate(PPI)was subjected to ultrasound treatment,and the effects of ultrasonic intensity on functional properties of PPI,such as solubility,foaming ability and foam stability,emulsifying properties,water binding ability and oil absorbency,were investigated. Results showed that ultrasonic intensity significantly influenced solubility,emulsifying capacity and emulsifying stability of PPI,and with the increase of ultrasonic intensity level,solubility of PPI were increased at first and then tended to maintain a steady value at ultrasonic intensity level of 69.36 W/cm2. Moreover,with the increase of ultrasonic intensity level,emulsifying capacity and emulsifying stability of PPI was increased at first and then tended to maintain a steady value at ultrasonic intensity level of 75.68 W/cm2and 59.28 W/cm2,respectively. However,foaming ability,foam stability,water binding ability and oil absorbency of PPI appeared in the trend of first increase then decrease with the increase of ultrasonic intensity. The highest value of foaming ability and foam stability were achieved at ultrasonic intensity of 69.36 W/cm2. Meanwhile,water binding ability and oil absorbency showed the peak value at ultrasonic intensity of 75.68 W/cm2and 49.35 W/cm2,respectively. From the above results,ultrasound treatment could be used to modify some functional properties of PPI by appropriate selection of ultrasonic intensity level.

ultrasound;pea protein isolate;functional properties

2015-04-09

王忠合(1980-),男,博士,講師,研究方向:食品加工與安全控制技術(shù),E-mail:wangzh20@163.com。

*通訊作者:王軍(1981-),女,博士,講師,研究方向:食品加工技術(shù),E-mail:wangjun19811210@163.com。

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013040015478);廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2013LYM0056);韓山師范學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(QD20130516 & QD20140324);韓山師范學(xué)院一般項(xiàng)目(LY201306);潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013X05 & 2013X06)資助。

TS214.9

A

1002-0306(2015)23-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.015