魯 群,淺井禎吾,大島吉輝

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.日本東北大學(xué)藥學(xué)研究科,宮城仙臺(tái) 980-8578)

18株植物內(nèi)生真菌的分離純化及鑒定

魯 群1,淺井禎吾2,大島吉輝2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.日本東北大學(xué)藥學(xué)研究科,宮城仙臺(tái) 980-8578)

植物內(nèi)生真菌生活環(huán)境特殊、種類多,通過大量的分離和篩選得到有價(jià)值的內(nèi)生真菌,可以為新型天然產(chǎn)物的獲得提供更豐富的來源。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采摘了12種植物,采用組織分離法從中有選擇性地分離純化得到了18株內(nèi)生真菌,通過28S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,對(duì)18株真菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,這18株內(nèi)生真菌主要屬于Cladosporium,Paramicrothyrium,Mycosphaerella,Colletotrichum,Corynespora,Sarocladium,Guignardia,Phoma,Pseudocercospora,Collembolispora,Alternaria,Glomerella等屬,說明了植物內(nèi)生真菌的豐富多樣性。得到的18株內(nèi)生真菌中有3株不常見真菌和一株新真菌,其次級(jí)代謝產(chǎn)物值得進(jìn)一步研究。

內(nèi)生真菌,分離,鑒定

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指在其生活史中部分或者全部時(shí)期生活在植物體內(nèi),而不會(huì)引起宿主植物產(chǎn)生明顯病害癥狀的一類真菌[1]。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物體中,來源廣、種類繁多,可以通過傳統(tǒng)的人工組織分離法獲得,操作簡便、成本低。內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物非常豐富,可以合成與宿主植物相同或不同的活性物質(zhì)[2]。1993年美國Stierle等[3]從短葉紅豆杉的韌皮組織中分離得到一株內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae),也可以合成抗癌物質(zhì)紫杉醇;另外有研究表明從內(nèi)生真菌分離得到的活性物質(zhì)中有50%以上是新化合物[4]。

內(nèi)生真菌合成的黃酮、生物堿、萜類、甾體等多種化合物大多具有抗菌、抗癌、生物防治等活性[5-6]。目前關(guān)于天然產(chǎn)物的研究中,對(duì)植物的研究較多,以至于植物的過度使用。內(nèi)生真菌的開發(fā)不僅可以解決資源問題,而且對(duì)新型天然產(chǎn)物的獲得具有重大意義。由于不同地域不同環(huán)境中植物的內(nèi)生真菌有所不同,不能準(zhǔn)確預(yù)測從某種植物中能分離得到哪些內(nèi)生真菌或是否能分離得到新菌株,所以本實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)采摘,采摘的12種植物大多數(shù)為藥用植物,希望能獲得產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。分離得到的內(nèi)生真菌采用分子手段對(duì)其進(jìn)行鑒定,rDNA序列分析是鑒定真菌的常用方法,其中28S rDNA基因序列進(jìn)化緩慢、相對(duì)保守,通過測定未知真菌的該序列,再與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較來鑒定真菌。

表1 采集植物信息

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物樣品 日本東北大學(xué)藥用植物園，分別采集植物的果實(shí)、葉、莖、根等部位,并做好詳細(xì)記錄,見表1;Prime STAR TAKARA公司;QIAEX II Gel Extraction Kit 德國Qiangen公司;選擇性分離培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)加氯霉素,氯霉素終濃度為50 μg/mL。

TP600梯度PCR儀 日本TaKaRa公司;PRISMTM310測序儀 美國ABI公司;Nanodrop 2000分光光度計(jì) 美國Thermo公司;YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;KA-1000臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物內(nèi)生真菌的分離純化 采用嚴(yán)格的表面消毒法分離植物中的內(nèi)生真菌[7-8]。采摘新鮮植物樣品,用流水沖洗干凈除去表面泥沙,組織較柔軟部位,如葉、花,放入80%乙醇溶液中消毒2 min;組織較硬部位,如根,先放入80%乙醇溶液中消毒1 min,再放入1%次氯酸鈉溶液中消毒5 min,最后放入80%乙醇溶液中消毒1 min。取出消毒后的植物組織,置于無菌培養(yǎng)皿中,剪取組織中間部分約0.5 cm×0.5 cm大小的小塊貼放于分離培養(yǎng)用平板中,每皿4塊。記錄植物名、部位、日期等,置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。植物內(nèi)生的真菌相對(duì)生長緩慢,大約培養(yǎng)后的第三天才開始緩慢生長,培養(yǎng)過程中根據(jù)菌落長出的時(shí)間、形態(tài)和顏色的差異等,分別挑取菌落邊緣的少量菌絲接于新的平板上,繼續(xù)培養(yǎng)并仔細(xì)觀察菌落特征,再挑取菌落邊緣的菌絲接于新的平板上,反復(fù)純化,最后得到純化的植物內(nèi)生真菌。

1.2.2 植物內(nèi)生真菌DNA的提取 內(nèi)生真菌基因組DNA的提取參考SDS法[9],稍加改進(jìn)。具體提取步驟如下:在超凈臺(tái)中挑取約1～2 cm2的菌體于無菌離心管中,研缽置于冰上,加入少量液氮,倒入菌體,迅速充分研磨,轉(zhuǎn)移至離心管。加200 μL TE和200 μL溶菌液(2% SDS,0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tris-HCl),渦旋,靜置5 min,15000 r/min離心30 s,上清液轉(zhuǎn)移。加400 μL抽提液,抽提液為苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25∶24∶1)。渦旋,15000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移。加1 mL無水乙醇和40 μL 3 mmol/L NaAc,15000 r/min離心15 min,舍棄上清液。加200 μL 70%乙醇,15000 r/min離心5 min,舍棄上清液。

1.2.3 目標(biāo)DNA片段的PCR擴(kuò)增 真菌基因組中編碼核糖體的基因28S rDNA中D1/D2區(qū)域序列長度適中,適用于真菌鑒定[10]。以提取的DNA為模板,利用rDNA的保守序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增未知真菌的28S rDNA D1/D2區(qū)域,引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。使用Prime STAR體系,反應(yīng)液總體積為15 μL,其組成見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR的反應(yīng)條件為:98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 40s,40次循環(huán);4 ℃ 保存。

1.2.4 DNA片段的回收 使用QIAEX II膠回收試劑盒對(duì)DNA片段進(jìn)行回收,具體操作步驟:PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖(Gene pure)凝膠電泳后,用ViewaBlue染色10 min。多次浸洗,切出被染色的目的DNA的瓊脂糖凝膠,稱重。加入3倍凝膠重量的溶膠液Buffer Q和10 μL QIAEX,渦旋。50 ℃ 加熱10 min。4 ℃ 12000 r/min離心30 s,舍棄上清液,加500 μL Buffer Q,渦旋。與上一步相同操作,加500 μL Buffer PE,渦旋。重復(fù)上一步,舍棄上清液,風(fēng)干。加20 μL超純水,渦旋,靜置5 min,4 ℃ 12000 r/min離心30 s,上清液轉(zhuǎn)移。重復(fù)此步驟。Nanodrop 2000測定儀測定DNA濃度。計(jì)算其在260 nm和280 nm的光吸收值的比值(OD260/OD280)。

表4 植物內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

1.2.5 測序 使用Big Dye測序試劑盒,將回收的DNA片段再一次PCR擴(kuò)增,引物NL1、NL4分別稀釋100倍。每個(gè)真菌樣品分別做兩個(gè)反應(yīng),一管中加入引物NL1,另一管中加入引物NL4,以保證測序的準(zhǔn)確性,反應(yīng)液總體積為10.6 μL,其組分見表3。

表3 測序用PCR反應(yīng)體系

PCR的反應(yīng)條件為:96 ℃ 1 min;96 ℃ 10 s,50 ℃ 5 s,60 ℃ 40 min,25次循環(huán);4 ℃ 保存。產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)移到離心管中,加30 μL 無水乙醇和0.625 μL 0.5 mol/L EDTA,靜置15 min,14000 r/min離心20 min。舍棄上清液,加30 μL 70%乙醇溶液,14000 r/min離心5 min。舍棄上清液,風(fēng)干,加26 μL HI-DI甲酰胺。96 ℃加熱2 min,置于冰上,將待測品全部轉(zhuǎn)移到測序管中,用DNA測序儀進(jìn)行序列測定。

1.2.6 測序結(jié)果分析 測序儀測定后,得到真菌28S rDNA D1/D2區(qū)域序列。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列相似性搜索,下載相似性高的菌株的序列,使用軟件ClustalX 1.8進(jìn)行多序列對(duì)比。再用軟件MEGA5.10進(jìn)行聚類分析,采用鄰位相連算法(Neighbor-Joining),通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測,自展次數(shù)為1000,選擇Kimura 2雙參數(shù)模型計(jì)算進(jìn)化距離,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分離得到的內(nèi)生真菌全部鑒定后,用上述方法進(jìn)行多序列對(duì)比及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

圖1 植物內(nèi)生真菌的照片F(xiàn)ig.1 Photos of endophytic fungi from plants注:(1)WLY,(2)WLJ,(3)SLGB,(4)SLGG,(5)RGY-1,(6)RGY-2,(7)FCMY,(8)TGJ,(9)HGZY,(10)HGZG,(11)YJJ,(12)BXG,(13)QMY,(14)QMG,(15)ZSY-1,(16)ZSY-2,(17)SLSY,(18)SCHY。

本實(shí)驗(yàn)共采摘12種植物,對(duì)果實(shí)、葉、莖等27個(gè)部位進(jìn)行表面消毒后培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,選擇性的分離純化了18株內(nèi)生真菌(表4),菌落形態(tài)見圖1。從表4和圖1可以看出,選擇的植物內(nèi)生真菌大多從葉片中分離得到,菌落大多具有顏色,與平時(shí)常見的絲狀真菌相比形態(tài)較為特別。

2.2 PCR產(chǎn)物的檢測

提取植物內(nèi)生真菌的基因組DNA,以其為模板,在特異性引物的引導(dǎo)下,PCR擴(kuò)增出內(nèi)生真菌28S rDNA D1/D2片段,回收目的DNA片段,進(jìn)一步純化。測定DNA的濃度并計(jì)算OD260/OD280值,結(jié)果見表5。OD260/OD280值在1.6～2.0之間,說明DNA沒有蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)污染;OD260/OD280值在1.8左右說明DNA純度最高。由表中可以看出,18組DNA的OD260/OD280值均在1.6～2.0之間,表明回收的DNA片段純度較高。

表5 回收DNA片段的定量

2.3 28S rDNA D1/D2區(qū)域序列的分析

測序儀測序得到18株植物內(nèi)生真菌的28S rDNA D1/D2區(qū)域堿基序列長均為600 bp左右,長度符合此區(qū)域序列。測序得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析,搜索出相似性高的序列,相似率達(dá)到99%以上說明相似性很高,再結(jié)合菌落形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定出內(nèi)生真菌(表6)。

菌株WLJ、SLGB、SLGG、RCY-1、RGY-2、FCMY、HGZG、YJJ、QMY、QMG和SLSY的序列在數(shù)據(jù)庫中均搜索到一株相似率最高的菌株,結(jié)果見表6。菌株WLY、TGJ、ZSY-2、SCHY的序列分別與Cladosporium、Colletotrichum、Alternaria、Glomerella屬的多株菌株的序列相似率最高,所以分別鑒定為Cladosporiumsp.、Colletotrichumsp.、Alternariasp.、Glomerellasp.。菌株HGZY與Guignardiamangiferae(KF955298.1)、Guignardiavaccinii(EU167584.1)、Phyllostictafallopiae(AB454307.1)、Dothideomycetessp. genotype 233(JQ760442.1)等多株菌株的序列相似率都達(dá)到100%,結(jié)合菌落形態(tài)特征分析,鑒定為Guignardiamangiferae。菌株BXG與Phialophorasp. 5H1-P3-P7-2(KM232467.1)、Acremoniumsp. 5H1_P3_P5_1(KM232466.1)、Mollisiadextrinospora(HM116757.1)、Protoventuriasp. M1069-OL(AB831875.1)和Collembolisporabarbata(KC005812.1)的序列相似率都達(dá)到99%,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)果顯示菌株BXG與Collembolisporabarbata在同一發(fā)育分支上,故鑒定為Collembolisporabarbata。

表6 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

圖2 內(nèi)生真菌BXG 28S rDNA D1/D2序列的聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of 28S rDNA D1/D2 sequence of endophytic fungus strain BXG

菌株ZSY-1與數(shù)據(jù)庫中搜索到的菌株的序列相似率都在87%以下,說明ZSY-1可能是新菌株,其28S rDNA D1/D2區(qū)域堿基序列如下:

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

18株植物內(nèi)生真菌鑒定后,使用軟件ClustalX 1.8對(duì)18株真菌的28S rDNA D1/D2序列進(jìn)行多重對(duì)比,再使用MEGA5.10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。從圖中可以直接看出各菌株的親緣關(guān)系和進(jìn)化地位;圖中顯示RGY-2和SLSY、RGY-1和TGJ的親緣關(guān)系高,與BLAST搜索得出的結(jié)果一致,RGY-2鑒定為Corynesporatorulosa、SLSY鑒定為Corynesporacassiicola,兩株真菌都是Corynespora屬,RGY-1鑒定為Colletotrichumboninense、TGJ鑒定為Colletotrichumsp.,兩株真菌都是Colletotrichum屬,但從菌落特征上看,TGJ和RGY-1明顯不是同一株真菌;BLAST搜索結(jié)果中有3株不常見真菌SLGB、QMY和QMG,雖然可以在數(shù)據(jù)庫中搜索到,但尚沒有屬種名稱,從圖3中可以看出QMG和HGZG(Phoma minor)的親緣關(guān)系高;在數(shù)據(jù)庫中未搜索到的菌株ZSY-1在圖中與其他菌株的親緣關(guān)系低。

圖3 基于28S rDNA D1/D2序列分析構(gòu)建的內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree constructed for endophytic fungi based on 28S rDNA D1/D2 sequence

3 結(jié)論

采用組織分離法從12種植物中選擇性分離純化得到18株內(nèi)生真菌,通過28S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定出18株植物內(nèi)生真菌主要屬于Cladosporium,Paramicrothyrium,Mycosphaerella,Colletotrichum,Corynespora,Sarocladium,Guignardia,Phoma,Pseudocercospora,Collembolispora,Alternaria,Glomerella等屬,其中菌株SLGB、QMY和QMG為3株不常見真菌,真菌ZSY-1經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索未搜索到相似序列,可能是新菌株。本研究結(jié)果說明了植物內(nèi)生真菌的豐富多樣性,是一類具有潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物資源,值得更充分深入的研究;本實(shí)驗(yàn)分離得到的內(nèi)生真菌,特別是新菌株,為天然產(chǎn)物的獲得和開發(fā)提供了更豐富的來源,其次級(jí)代謝產(chǎn)物值得進(jìn)一步研究。

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Isolation and identification of 18 strains of endophytic fungi from plants

LU Qun1,TEIGO Asai2,YOSHITERU Oshima2

(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Graduate School of Pharmaceutical Sciences,Tohoku University,Sendai 980-8578,Japan)

Plant endophytic fungi have the characteristics of special living environment and variety. By a large number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi,it can provide more sources for novel natural products. In this study,12 kinds of plants were randomly picked. 18 strains of endophytic fungi were isolated by traditional artificial separation method. These endophytic fungi were identified using 28S rDNA sequencing and phylogenies. The results showed that 18 strains of endophytic fungi mainly belonged toCladosporium,Paramicrothyrium,Mycosphaerella,Colletotrichum,Corynespora,Sarocladium,Guignardia,Phoma,Pseudocercospora,Collembolispora,AlternariaandGlomerellasp.,indicating the rich diversity of endophytic fungi. Among these fungi,there were three rare strains and a new strain of fungi. The secondary metabolites of these fungi were worth further studying.

endophytic fungi;isolation;identification

2015-02-12

魯群(1987-),女,博士,講師,研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)與食品功能因子,E-mail:luqun@mail.hazu.edu.cn。

中國國家留學(xué)基金委資助。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.023