佟婷婷,田豐偉,王 剛,劉小鳴,張 灝,陳 衛(wèi)

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

基于宏基因組分析四川泡菜母水作引子的泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化

佟婷婷,田豐偉,王 剛,劉小鳴,張 灝,陳 衛(wèi)*

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本文旨在研究以泡菜母水作引子的蔬菜發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化,并對(duì)泡菜質(zhì)量控制和泡菜中功能性細(xì)菌資源開發(fā)提供理論支持。采集發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時(shí)間的樣品,提取基因組,PCR擴(kuò)增16S rRNA的V3+V4區(qū)并進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序,通過生物信息學(xué)分析比較發(fā)酵不同時(shí)間細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明:以老壇水作引子的發(fā)酵過程中發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)魏斯氏菌屬可達(dá)到74.5%,而之后則在10%左右,取而代之成為優(yōu)勢(shì)菌的是乳桿菌屬,含量達(dá)到80%～85%。說明泡菜發(fā)酵中啟動(dòng)菌為魏斯氏菌屬,發(fā)酵的關(guān)鍵菌為乳桿菌屬,同時(shí)表明四川泡菜是優(yōu)良的微生物資源,可用于魏斯氏菌屬,乳桿菌屬,乳球菌屬,片球菌屬和明串珠菌屬等益生菌的分離和篩選。

宏基因組,泡菜,母水引子,發(fā)酵過程,細(xì)菌多樣性

泡菜是中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的代表,其中又以四川泡菜最為著名,是以新鮮蔬菜為原料,添加泡菜鹽、水和調(diào)味料,利用蔬菜自身附著的微生物或添加乳酸菌發(fā)酵劑,自然發(fā)酵而成具有獨(dú)特風(fēng)味的食品[1]。近年來,四川泡菜作為優(yōu)秀的菌種資源受到越來越多人的關(guān)注,尤其是從中篩選出的優(yōu)良乳酸菌,具有很多特殊功能,如董玲等從四川泡菜中篩選出了2株產(chǎn)γ-氨基丁酸的短乳桿菌[3],楊婧等則從四川泡菜中獲得了一株對(duì)細(xì)菌和產(chǎn)璞酵母均有良好抑制作用的植物乳桿菌[4],而汪紅等從四川泡菜中分離出了一株產(chǎn)酸能力強(qiáng),生長(zhǎng)速度快的乳酸乳球菌[5]。

長(zhǎng)期以來,人們主要采取的是傳統(tǒng)的菌種篩選方法,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使得從基因角度全面分析環(huán)境中的微生物多樣性成為可能,而對(duì)泡菜中微生物深入的研究有助于更好地利用泡菜資源。田偉[6]等人通過16S rRNA的方法分析了四川泡菜中的細(xì)菌多樣性,陳功等[7]采用DGGE的方法測(cè)定了泡菜中的細(xì)菌多樣性。宏基因組作為目前分析環(huán)境中微生物多樣性最有效的方法,在土壤[8]、人類腸道[9]、海水[10]的微生物多樣性研究中都有很好的應(yīng)用,能夠?qū)?fù)雜環(huán)境中的微生物組成進(jìn)行有效分析并對(duì)不同樣品的進(jìn)化關(guān)系探究,而在泡菜中應(yīng)用極少。本文為了探究四川泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌的多樣性及其變化,特采用宏基因組的方法,以求對(duì)四川泡菜發(fā)酵過程有更全面的認(rèn)識(shí),同時(shí)為篩選優(yōu)良菌株提供參考。

表1 16S rRNA V3+V4區(qū)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜母水 四川省內(nèi)江市一戶農(nóng)家的老壇(該泡菜采用傳統(tǒng)方法泡制且品質(zhì)符合當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶對(duì)優(yōu)良泡菜的判定);泡菜鹽和花椒等調(diào)料 內(nèi)江菜市場(chǎng);白蘿卜、胡蘿卜 無錫雪浪菜市場(chǎng);DNA提取試劑盒Fast DNA SPIN Kit for soil MP Biomedicals LLC公司;PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase TransGen公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 AXYGEN公司;建庫(kù)試劑盒 TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)和上機(jī)試劑盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003) Illumination公司。

Miseq測(cè)序儀 Illumina公司;Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)和PowerPac核酸電泳儀 Bio-Rad公司;PCR儀GeneAmp? 9700型 ABI公司;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) Promega公司;Nano Drop2000微量分光光度計(jì) Thermo Scientific公司;MS3旋渦混合器 德國(guó)IKA公司;Minispin離心機(jī) Eppendorf公司;SCIENTZ-09無菌均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 以四川泡菜母水作引子泡菜制備 本實(shí)驗(yàn)的泡菜制作模擬傳統(tǒng)四川泡菜制作過程,將5 L的泡菜壇用100 ℃水沖洗后,紫外照射下晾干,用泡菜鹽和自來水配成濃度為4%的鹽水2.5 L,煮沸5 min后冷卻至室溫入壇,向壇中加入500 mL泡菜母水,50粒花椒和10個(gè)鮮辣椒,攪勻;新鮮的白蘿卜、胡蘿卜去皮,切成2 cm×2 cm×10 cm的蔬菜條,入壇至液面高度距壇口5 cm;蓋上蓋子,在壇沿加上淡鹽水,將泡菜壇置于陰涼處自然發(fā)酵。

在第0、1、3、7、16、20 d分別從泡菜壇中取樣,共6個(gè)樣品,分別記作0、1、3、7、16、20 d。樣品的處理方式為:將泡制后蔬菜剪碎后與泡菜液一起放入無菌均質(zhì)袋中,在6檔下均質(zhì)1 min,之后8層無菌紗布過濾取出蔬菜殘?jiān)?再將濾液4 ℃,10000 r/min下離心10 min獲得菌體,置于-80 ℃冰箱中保存待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 泡菜微生物的提取與檢測(cè) 由于泡菜菌體中會(huì)混有蔬菜殘?jiān)驼{(diào)料殘?jiān)?屬于復(fù)雜的環(huán)境體系,故采用QIAGEN糞便基因組提取試劑盒提取樣本總DNA,具體操作步驟參照說明書。提取的總DNA經(jīng)Nanodrop2000微量分光光度計(jì)測(cè)定純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[11-12]。

1.2.3 16S rRNA V3+V4區(qū)基因片段的擴(kuò)增及Illumina測(cè)序 對(duì)于6個(gè)樣品,由提取的基因組直接擴(kuò)增V3+V4區(qū)基因片段,使用的引物為338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)體系見表1。

PCR條件為:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃最終延伸10 min,10 ℃ 保溫。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測(cè)[13-14]。

參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量,之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。之后用試劑盒TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建:連接“Y”字形接頭;使用磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集;氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。

針對(duì)已構(gòu)建文庫(kù),用試劑盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003)進(jìn)行Miseq測(cè)序:DNA片段的一段與引物堿基互補(bǔ),固定在芯片上;另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ),也被固定住,形成“橋(bridge)”;PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生DNA簇;DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈;加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP,每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基;用激光掃描反應(yīng)板表面,讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類;將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割,恢復(fù)3′端粘性,繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸;統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果,獲知模板DNA片段的序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,舍棄低質(zhì)量序列,所得片段大小平均長(zhǎng)度為447.31 bp,接近目標(biāo)片段。區(qū)分樣品后在97%的相似水平下對(duì)OTU(Operational Taxonomic Unit,操作分類單元)進(jìn)行聚類分析,檢測(cè) PCR 擴(kuò)增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除,使用usearch_global方法將優(yōu)化序列 map比對(duì)回OTU代表序列,得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計(jì)表[15-16]。

采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,在門和屬水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。進(jìn)一步對(duì)微生物測(cè)序進(jìn)行深度分析,繪制稀釋性曲線(Rarefaction curve)、Shannon-Wiener曲線;對(duì)樣品的Chao,Ace,Shannon,Simpson指數(shù)進(jìn)行計(jì)算,分析細(xì)菌群落豐度和多樣性;基于細(xì)菌群落的組成,在門和屬兩個(gè)分類水平上研究發(fā)酵過程中細(xì)菌組成和多樣性的變化[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因組,OTUs,序列數(shù)目分布和測(cè)序深度分析

分別對(duì)6個(gè)樣品的總基因組進(jìn)行提取,并針對(duì)16S rRNA V3+V4區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物利用高通量Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序,統(tǒng)計(jì)得到的序列數(shù)目,并在97%的相似水平下進(jìn)行歸類操作得到OTU數(shù),見表2。對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行分析,隨機(jī)對(duì)測(cè)序所得序列抽樣,以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線,見圖2。當(dāng)曲線趨于平坦時(shí),說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU;反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。

圖1 6個(gè)樣品基因組PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.1 PCR products of Genom of 6 Samples注:1,2,3,4,5,6分別代表0,1,3,7,16,20 d;DL2000為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

由圖1可知,6個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的位置都有清晰的條帶,證明PCR 產(chǎn)物目的條帶大小正確,濃度合適,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供了保障。

表2 6個(gè)樣品高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

由表2可知,6個(gè)樣品獲得的序列數(shù)在15400到26100的范圍內(nèi),在97%的相似水平下對(duì)序列進(jìn)行歸類操作,獲得的OUT數(shù)在14300到25000的范圍內(nèi)?？傮w上看,除去1 d,發(fā)酵后期的序列數(shù)和OUT數(shù)高于發(fā)酵前期。

由圖2可知,對(duì)于6個(gè)樣品而言,隨著抽取序列數(shù)量的增加,它們所代表的OTU數(shù)先增加后基本保持不變,即隨著測(cè)序深度增加,曲線斜率減小,最終趨于平緩,說明測(cè)序深度能夠較準(zhǔn)確地反映泡菜樣品的豐富度和多樣性。

圖2 6個(gè)樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction Curve of 6 samples

2.2 泡菜發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)取樣品的細(xì)菌多樣性分析

針對(duì)獲得的OTU,利用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)可以估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性,單樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)包括菌群豐度指數(shù)chao1和ace,菌群多樣性指數(shù)simpson和shannon,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。其中,chao1用來估計(jì)物種總數(shù),ace可估計(jì)群落中OTU數(shù)目,simpson和shannon用于估算為生物多樣性,simpson越大多樣性越低,而shannon越大多樣性越高[18]。

表3 菌群多樣性指數(shù)

由表3可得,simpson越大多樣性越低,則多樣性由低到高為3,20,1,7,16,0 d;而根據(jù)shannon越大多樣性越高,則多樣性由低到高為3,1,20,7,16,0 d。由此可看出泡菜發(fā)酵過程中微生物多樣性是變化著的,不是簡(jiǎn)單的越來越豐富或越來越單一,發(fā)酵開始是細(xì)菌多樣性最高,發(fā)酵初期出現(xiàn)細(xì)菌多樣性下降,到發(fā)酵后期又有一定上升。

2.3 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌組成在門水平上的變化

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在門水平(phylum)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。使用的比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)。根據(jù)各個(gè)樣品不同門微生物所占比例進(jìn)行作圖,在一個(gè)樣品中某一門的微生物所占的比例即為其相對(duì)豐富度,作圖時(shí)將相對(duì)豐富度低于1%的部分合并為其他在圖中顯示,結(jié)果見圖3。

圖3 6個(gè)樣品在門的水平上細(xì)菌組成Fig.3 The composition of the samples of bacteria at phylum

由圖3中可以看出,在泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌主要來自厚壁菌門(Firmicutes),藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)和變形菌門(Proteobacteria),其中厚壁菌門所占比例具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由圖3分析可知,總體上隨著發(fā)酵進(jìn)行,厚壁菌門含量也有升高的趨勢(shì),而藍(lán)藻菌門和變形菌門所占比例分別在一定程度上下降。

2.4 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌組成在屬水平上的變化

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì) 97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在屬水平(genus)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。采用數(shù)據(jù)庫(kù)Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)各個(gè)樣品不同屬微生物所占比例進(jìn)行作圖,作圖時(shí)將相對(duì)豐富度低于1%的部分合并為其他在圖中顯示,結(jié)果見圖4。

圖4 6個(gè)樣品在屬的水平上細(xì)菌組成Fig.4 The composition of the samples of bacteria at genus

由圖4中可以看出,在屬的水平上,泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌主要屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),魏斯氏菌屬(Weissella),乳球菌屬(Lactococcus),片球菌屬(Pediococcus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)。通過比較發(fā)現(xiàn),除了1 d中魏斯氏菌屬含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均為乳桿菌屬。在整個(gè)發(fā)酵過程中,乳桿菌屬整體上的趨勢(shì)為含量先下降后上升,0 d時(shí)為75.6%,1 d時(shí)為18.0%,之后的含量在80%～85%之間;魏斯氏菌屬0 d幾乎沒有,1 d時(shí)含量達(dá)到74.5%,之后保持在10%左右;乳球菌屬在0 d時(shí)占5.3%,在之后的發(fā)酵過程中則幾乎沒有;片球菌屬含量在發(fā)酵過程中在1%～7%之間變動(dòng),且無明顯規(guī)律;明串珠菌屬在0 d時(shí)占4.2%,在之后的發(fā)酵過程中幾乎沒有。由以上規(guī)律可推測(cè),泡菜發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用的是乳桿菌屬;在發(fā)酵初期作用顯著的是魏斯氏菌屬,該菌屬在韓國(guó)泡菜kimchi中有所報(bào)道并且是主要微生物[19];隨著發(fā)酵進(jìn)行一些菌屬所占的比例從不到6%降到極低,如乳球菌屬和明串珠菌屬,它們對(duì)泡菜的發(fā)酵是否起到作用有待進(jìn)一步探索。魏斯氏菌屬在此發(fā)酵過程中起到了啟動(dòng)菌的作用,這與一些文獻(xiàn)中報(bào)道的啟動(dòng)菌是明串珠菌屬[20]不符,分析原因可能是此類報(bào)道大多參考的是Pederson[21]在1930年時(shí)的研究,而魏斯氏菌屬與明串珠菌和乳桿菌很相似[22],在1993年時(shí)Collins[23]等人根據(jù)細(xì)菌的16S rRNA將副腸系膜樣明串珠菌屬(Leuconostoc paramesenteroides)和相關(guān)菌重新分類,形成了魏斯氏菌屬(Weissella),因此在這之前的研究可能鑒于當(dāng)時(shí)分類水平的限制并沒有進(jìn)行正確的鑒定;同時(shí)也有可能是研究對(duì)象和條件不同造成差異,如Eom等人的研究選用明串珠菌作為韓國(guó)泡菜kimchi的啟動(dòng)菌[24-25]。魏斯氏菌屬作為啟動(dòng)菌還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究利用Illumina高通量測(cè)序獲得16S rRNA的V3+V4可變區(qū)序列,基于該分子標(biāo)志鑒定泡菜的細(xì)菌種類,說明V3+V4序列在泡菜細(xì)菌的分類中解析度良好。通過測(cè)序及生物信息學(xué)分析,可得出如下結(jié)論:在泡菜發(fā)酵過程中,微生物多樣性是變化著的,而不是簡(jiǎn)單的越來越豐富或越來越單一。在門的水平上看,泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌主要來自厚壁菌門,藍(lán)藻菌門和變形菌門,其中厚壁菌門所占比例具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在屬的水平上,泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌主要屬于乳桿菌屬,魏斯氏菌屬,乳球菌屬,片球菌屬和明串珠菌屬。除了1 d中魏斯氏菌屬含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均為乳桿菌屬。因此欲從發(fā)酵蔬菜中分離得魏斯氏菌屬,則可對(duì)發(fā)酵初期的發(fā)酵液進(jìn)行微生物分離篩選,同時(shí)可推測(cè)魏斯氏菌屬是在蔬菜發(fā)酵的啟動(dòng)中起重要作用。發(fā)酵后期的發(fā)酵液則是乳桿菌屬微生物的優(yōu)良來源。隨著發(fā)酵進(jìn)行含量降到極低的乳球菌屬和明串珠菌屬可能因?yàn)椴贿m合發(fā)酵后期的環(huán)境而受到抑制。本文僅分析了發(fā)酵過程中不同階段的細(xì)菌多樣性組成,而不同菌屬具體如何作用需要代謝組學(xué)進(jìn)一步探索。

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Metagenomic analysis of bacterial diversity changes during vegetables fermentation using Sichuan pickle water as starter

TONG Ting-ting,TIAN Feng-wei,WANG Gang,LIU Xiao-ming,ZHANG Hao,CHEN Wei*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The purpose of the present study was to investigate the bacterial diversity in Sichuan pickles during the fermentation started by mother water starter,in order to provide support for the quality control and functional bacterial screening in pickles. Samples during the fermentation were collected for genome extraction,and the V3+V4 parts of 16S rRNA of each sample’s genome were amplified by PCR. The samples were then sequenced by Illumina miseqsequencing system. Bioinformatics was finally analyzed to compare bacterial deversity of the samples. The results showed that,the abundance of Weissella was 74.5% at the beginning of the fermentation but then decreased and remained stable at about 10%. After the start of the fermentation,the Lactobacillus strains took place to be the dominationated bacteria,with a content of 80%～85%. These results indicated that during the fermentation,Weissella was the starter culture and Lactobacilli dominated the fermentation process afterwards. It can be concluded that Sichuan pickles were proved to be excellent microbial resources for the collection of probiotics including Weissella,Lactobacillus,Lactococcus,Pediococcus and Leuconostoc strains.

Metagenome;pickled vegetables;mother water starter;fermentation process;bacterial diversity

2015-01-23

佟婷婷(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù),E-mail:tongtt2015@163.com。

*通訊作者:陳衛(wèi)(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù),E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD18B01)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31371721)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.027