董 妍,胡文忠,何煜波,姜愛麗,馮 可,李曉博

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

多重PCR快速檢測兩種致瀉性大腸桿菌方法的建立

董 妍1,胡文忠2，*,何煜波2,姜愛麗2,馮 可3,李曉博2

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

本研究以腸出血性大腸桿菌O157∶H7及腸侵襲性大腸桿菌為目標菌,針對大腸桿菌共同基因uidA、腸出血性大腸桿菌O157∶H7的特異基因O-antigen、腸侵襲性大腸桿菌的特異基因ipaH設(shè)計3對引物,建立并優(yōu)化了檢測兩種菌的多重PCR檢測方法,進行了特異性驗證和靈敏度分析,并應(yīng)用于人工接種新鮮萵苣的檢測中。實驗結(jié)果表明,本研究建立的三重PCR快速檢測兩種致病菌的檢出限為6.3×103CFU/mL,具有較好的靈敏度和特異性。利用所建立的多重PCR方法對人工接種腸出血性大腸桿菌O157∶H7和腸侵襲性大腸桿菌的新鮮萵苣進行檢測,檢出限為7.8×104CFU/mL。此方法能夠?qū)δc出血性大腸桿菌O157∶H7和腸侵襲性大腸桿菌兩種食源性致病菌進行快速檢測。

多重PCR,快速檢測,腸出血性大腸桿菌O157∶H7,腸侵襲性大腸桿菌

表1 多重PCR引物序列

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)作為人和動物腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌,大部分不具有致病性,但是少部分血清型的大腸桿菌可以引起人體以腹瀉癥狀為主的疾病,嚴重者可危及生命。根據(jù)不同血清型的致瀉大腸桿菌的生物學(xué)特性,國際上將其分為腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicE.coli,EPEC)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE.coli,EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli,EIEC)和腸粘附性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli,EAEC)五大類[1]。致瀉大腸桿菌可引起食源性疾病的傳播與暴發(fā),在我國是主要的食源性致病菌之一,因此,針對不同血清型的致瀉大腸桿菌研究快速、特異、靈敏的檢測方法,對保障食品安全及人們生命健康有著重要意義。

腸出血性大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌最常見的血清型,具有致病性強、死亡率高的特點,并且其感染劑量極低,感染10～100個活菌即可致病;EIEC可引起發(fā)熱、劇烈腹痛、嚴重水樣腹瀉、血性腹瀉等癥狀,是引起痢疾樣腹瀉的重要食源性致病菌之一[2]。因此,快速、特異、靈敏地檢測兩種致瀉性大腸桿菌對有效控制食源性致病菌的傳播、預(yù)防食源性疾病的暴發(fā)至關(guān)重要。

檢測不同血清型的致瀉大腸桿菌常用傳統(tǒng)檢測方法,但它存在著操作復(fù)雜、檢測周期長、檢測單一、檢測成本高等不足,并且食品中的致病菌往往數(shù)量較少,應(yīng)用傳統(tǒng)檢測方法會造成漏檢的結(jié)果,越來越不能滿足人們對食品質(zhì)量與安全的要求[3]。隨著食源性致病菌檢測技術(shù)的高速發(fā)展,分子生物學(xué)因高效、靈敏、準確,普遍應(yīng)用于食源性致病菌檢測中。特別是多重PCR技術(shù),能夠同時檢測多種致病菌,與實時熒光定量PCR等其他分子生物學(xué)技術(shù)相比,提高檢測效率的同時也降低了檢測成本,具有廣闊的發(fā)展前景而成為研究熱點之一[4]。

本研究針對EHEC O157∶H7和EIEC的毒力基因和大腸桿菌的共有基因,設(shè)計了三對特異性引物,建立了同時檢測EHEC O157∶H7和EIEC的多重PCR方法,以期為快速檢測食品中不同血清型致瀉性大腸桿菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 腸出血性大腸桿菌標準菌株O157∶H7 CICC 21530、腸侵襲性大腸桿菌標準菌株CICC 10661、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌標準菌株CICC 10414、腸致病性大腸桿菌標準菌株CICC 10372、大腸桿菌標準菌株CMCC 44102、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)標準菌株ATCC 14028、乙型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiB)標準菌株CMCC 50094、三株單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)標準菌株ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)標準菌株ATCC 6538、副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus)標準菌株CICC 10435,均由大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院食品安全實驗室提供。

試劑 LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);乳糖、甘露醇等為國產(chǎn)分析純試劑;瓊脂糖由BIOWEST公司生產(chǎn),GelRed染料由Biotium公司生產(chǎn);10×PCR Buffer(Mg2+free)、細菌DNA提取試劑盒等由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。

DYCP-31F型電泳儀 由北京市六一儀器廠生產(chǎn);BioSpectrum 310 凝膠成像系統(tǒng)由美國UVP公司生產(chǎn);Thermo Arktic PCR儀 由Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn);全自動高壓滅菌鍋由SANYO公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 針對EHEC O157∶H7的毒力基因O-antigen[5]、EIEC的毒力基因ipaH[6],以及大腸桿菌共同的基因uidA[7],根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)序列,應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設(shè)計3對特異性引物[8],引物序列見表1,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 菌懸液和DNA模板的制備 將兩種致瀉大腸桿菌的標準菌株分別接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中已加入了0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖[9],37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,得到菌懸液。取菌懸液1 mL,用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR反應(yīng)的建立 分別以EHEC O157∶H7和EIEC的基因組DNA為模板。反應(yīng)體系為25 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2 μL,DNA模板(EHEC O157∶H7的DNA模板濃度為16.8 ng/μL;EIEC的DNA模板濃度為10.75 ng/μL)2.5 μL,引物(4 μmol/L)各1 μL,rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL,加RNase-Free Water至25 μL;在反應(yīng)中設(shè)置梯度退火溫度以明確最佳退火溫度,依次為51.0、51.6、52.4、53.4、54.6、56.1、57.5、58.5、59.3、60 ℃,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃ 30 s、梯度退火溫度30 s、72 ℃ 40 s,34個循環(huán),72 ℃延伸7 min[10]。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,95 v電泳1 h,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果[11]。

1.2.4 多重PCR 反應(yīng)的建立 多重PCR反應(yīng)體系為25 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2 μL,DNA模板(EHEC O157∶H7的DNA模板濃度為16.8 ng/μL;EIEC的DNA模板濃度為10.75 ng/μL)各1 μL,引物(4 μmol/L)各1 μL,rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL,加RNase-Free Water至25 μL。按建立的單重PCR反應(yīng)條件進行擴增。

1.2.5 多重PCR反應(yīng)的優(yōu)化 Mg2+(25 mmol/L)添加量的優(yōu)化:反應(yīng)體系中Mg2+的添加量依次為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL;rTaq酶(5 U/μL)添加量的優(yōu)化:反應(yīng)體系中rTaq酶的添加量依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL;引物(4 μmol/L)添加量的優(yōu)化:在合理的引物終濃度范圍內(nèi)選擇0.12、0.16、0.2 μmol/L三個水平,以0.04 μmol/L的濃度梯度遞增,折合為在反應(yīng)體系內(nèi)應(yīng)添加的體積,通過L9(33)正交設(shè)計表(表2)進行實驗;退火溫度的優(yōu)化:退火溫度依次設(shè)置為51.0、51.6、52.4、53.4、54.6、56.1、57.5、58.5、59.3、60 ℃。根據(jù)各項優(yōu)化結(jié)果選出體系中Mg2+、rTaq酶、引物的最適添加量及最適的退火溫度。

表2 引物添加量優(yōu)化實驗正交設(shè)計表

注:添加量單位為μL。

1.2.6 多重PCR反應(yīng)特異性驗證 為驗證上述建立的多重PCR方法的準確性,按建立好的多重PCR反應(yīng),每組按照表3添加模板DNA和引物,進行擴增反應(yīng)。同時以EHEC O157∶H7標準菌株CICC 21530、EIEC標準菌株CICC 10661、ETEC標準菌株CICC 10414、EPEC標準菌株CICC 10372、大腸桿菌標準菌株CMCC 44102、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株ATCC 14028、乙型副傷寒沙門氏菌標準菌株CMCC 50094、三株單增李斯特菌標準菌株ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 6538、副溶血性弧菌標準菌株CICC 10435的DNA為模板,對引物進行特異性驗證,并用RNase-Free Water作空白對照。

1.2.7 多重PCR反應(yīng)檢出限檢測 將菌懸液分別用無菌生理鹽水按10倍梯度稀釋至10-6,取1 mL用細菌DNA提取試劑盒提取模板DNA,按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行擴增。同時,兩種菌各取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度按照涂布法進行菌落計數(shù),以確定細菌的濃度。

1.2.8 應(yīng)用多重PCR方法檢測人工模擬樣品 將新鮮萵苣用無菌水洗凈后在75%的酒精中浸泡10 min,取出在無菌操作下取出置于無菌的生物安全柜中通風至酒精完全揮發(fā),此時萵苣樣品表面干燥,無酒精液滴存在,此過程要將萵苣樣品盡量平鋪以獲得盡可能大的揮發(fā)面積。稱取10 g,加入到90 mL已添加了0.3 g/100mL的甘露醇和1.0%的乳糖的LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,取菌懸液1 mL加入,37 ℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后均質(zhì),將均質(zhì)液用無菌生理鹽水按10倍梯度稀釋至10-6,取1 mL用細菌DNA提取試劑盒提取模板DNA,按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行擴增。同時,兩種菌各取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度按照涂布法進行菌落計數(shù),以確定樣品中細菌的濃度。

表3 準確性驗證實驗

注:“+”代表添加;“-”代表不添加。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR反應(yīng)的建立

研究中對各個引物的退火溫度進行了選擇(圖1),結(jié)果顯示EHEC O157∶H7和EIEC在所有溫度梯度均可以擴增出目標條帶,且擴增條帶的亮度幾乎無差異,而大腸桿菌的通用引物隨著退火溫度的增加,擴增出的條帶逐漸暗淡,在51.0～54.6 ℃的溫度范圍內(nèi),擴增出的條帶都清晰明亮,說明在此范圍內(nèi)的溫度均能夠高效擴增,滿足實驗要求,因此選擇53 ℃為單重PCR擴增的退火溫度。建立的單重PCR反應(yīng)見圖2,EHEC O157∶H7在178 bp處出現(xiàn)目的條帶,EIEC在303 bp處出現(xiàn)目的條帶,大腸桿菌通用引物對兩種致瀉大腸桿菌模板DNA分別擴增,都在446 bp處出現(xiàn)的目的條帶,目的條帶與預(yù)期大小符合。

圖1 單重PCR反應(yīng)退火溫度的選擇Fig.1 Optimization of single PCR annealing temperature注:M:Marker;1～10:退火溫度分別為51.0、51.6、52.4、53.4、54.6、56.1、57.5、58.5、59.3、60 ℃。

圖2 單重PCR反應(yīng)的建立Fig.2 Establishment of single PCR注:M:Marker;1:陰性對照;2:EHEC O157∶H7(O-antigen基因);3:EIEC(ipaH基因);4:EHEC O157∶H7(uidA基因);5:EIEC(uidA基因)。

2.2 多重PCR反應(yīng)的建立

多重PCR反應(yīng)結(jié)果顯示(圖3),對EHEC O157∶H7的O-antigen基因和uidA基因進行雙重擴增反應(yīng),在178 bp和446 bp處出現(xiàn)兩條特異性目的條帶;對EIEC的ipaH基因和uidA基因進行雙重擴增反應(yīng),在303 bp和446 bp處出現(xiàn)兩條特異性目的條帶;將兩種致瀉大腸桿菌組合后對三種目的基因進行多重PCR反應(yīng),在178、303、446 bp處出現(xiàn)三條特異性目的條帶。目的條帶與預(yù)期大小符合,條帶清晰且無非特異性擴增。

圖3 多重PCR反應(yīng)的建立Fig.3 Establishment of multiplex PCR注:M:Marker;1:陰性對照;2:EHEC O157∶H7;3:EIEC;4:EHEC O157∶H7和EIEC。

2.3 多重PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果

圖4 多重PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果Fig.4 The optimization results of multiplex PCR注:圖A(M:Marker;1～7:Mg2+添加量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL);圖B(M:Marker;1～6:rTaq酶添加量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL);圖C(M:Marker;1～9:引物添加量見表2);圖D(M:Marker;1～10:退火溫度分別為51.0、51.6、52.4、53.4、54.6、56.1、57.5、58.5、59.3、60 ℃)。

對多重PCR反應(yīng)優(yōu)化的結(jié)果見圖4。不同的Mg2+(25 mmol/L)添加量均可以擴增出目的條帶,添加量為2.5～4.0 μL時存在非特異性擴增條帶,根據(jù)擴增條帶的明暗程度,Mg2+的添加量選擇2.0 μL。rTaq酶(5 U/μL)添加量為0.3～0.6 μL時存在非特異性擴增條帶,根據(jù)目標條帶的明暗,rTaq酶添加量選擇0.2 μL。通過正交實驗對引物(4 μmol/L)的添加量進行優(yōu)化的結(jié)果顯示,在所有引物添加組別中均未出現(xiàn)非特異性擴增條帶,當引物添加組別為第5組、第6組、第7組時,擴增出的目標條帶較明亮,進一步比較三個組別,第6組擴增出的三條目標條帶的明暗程度相差較大,uidA基因引物擴增出的條帶亮度明顯微弱于其余兩條條帶,不適合在多重PCR反應(yīng)中應(yīng)用,第7組擴增出的三條條帶存在拖尾的現(xiàn)象,并且存在不同程度的條帶下移現(xiàn)象,與預(yù)期片段長度稍有偏差,特別是uidA基因引物擴增出的條帶,拖尾和下移情況明顯,不適合在多重PCR反應(yīng)中應(yīng)用,因此引物添加量選擇的組別為第5組,具體添加量為:O-antigen基因的引物為1 μL,ipaH基因的引物為1 μL,uidA基因的引物為1.25 μL。

對退火溫度進行優(yōu)化的結(jié)果顯示,在51 ℃時存在非特異性擴增,在溫度為51.6～53.3 ℃的范圍內(nèi),擴增出的目標條帶最明亮,說明此范圍內(nèi)的溫度均可以滿足實驗要求,從54.6 ℃開始,擴增條帶越來越暗淡,表現(xiàn)最明顯的是uid基因引物擴增出的目標條帶,在59.3 ℃以后,不能擴增出目標條帶,適當提高退火溫度可以避免非特異擴增的產(chǎn)生,并且考慮到PCR儀存在著不可避免的溫度誤差,因此在51.6～53.3 ℃的溫度范圍內(nèi),退火溫度選擇53 ℃即可滿足實驗要求。

最終建立的多重PCR反應(yīng)體系為:10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL,DNA模板各1 μL,O-antigen基因引物(4 μmol/L)各1 μL,ipaH基因引物各1 μL,uidA基因引物各1.25 μL,rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,加RNase-Free Water至25 μL。多重PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,34個循環(huán),72 ℃延伸7 min。

2. 4 多重PCR反應(yīng)特異性驗證

對建立的多重PCR反應(yīng)的準確性進行驗證時,通過對不同組合的模板DNA和引物進行擴增反應(yīng),均獲得了預(yù)期的擴增條帶(圖5),沒有非特異性擴增條帶產(chǎn)生;用所建立的多重PCR 方法進行特異性檢測,結(jié)果顯示(圖6),O-antigen基因引物只能特異性擴增EHEC O157∶H7,ipaH基因引物只能特異性擴增EIEC,uidA基因引物能夠擴增出所有種類的大腸桿菌,包括EHEC O157∶H7、EIEC、ETEC、EPEC和大腸桿菌CMCC 44102,而其他菌擴增結(jié)果均為陰性,說明所建立的方法特異性良好。

圖5 多重PCR反應(yīng)準確性驗證結(jié)果Fig.5 The results of accuracy verification 注:M:Marker;1～12:與表3組號一致。

圖6 多重PCR反應(yīng)特異性驗證結(jié)果Fig.6 The specificity of multiple PCR注:M:Marker;1:陰性對照;2:陽性對照;3:EHEC O157∶H7;4:EIEC;5:ETEC;6:EPEC;7:大腸桿菌CMCC 44102;8:鼠傷寒沙門氏菌;9:乙型副傷寒沙門氏菌;10～12:單增李斯特;13:金黃色葡萄球菌;14:副溶血性弧菌。

2. 5 多重PCR反應(yīng)靈敏度檢測

應(yīng)用所建立的多重PCR反應(yīng)對梯度濃度的菌液進行擴增(圖7),結(jié)合菌落計數(shù),結(jié)果顯示,菌液從6.3×107CFU/mL稀釋至6.3×103CFU/mL時,有擴增條帶出現(xiàn),因此此方法同時檢測EHEC O157∶H7和EIEC的檢出限為6.3×103CFU/mL。

圖7 多重PCR反應(yīng)檢測2種致瀉大腸桿菌的檢出限Fig.7 The sensitivity of detection of two Diarrheagenic Escherichia coli注:M:Marker;1:6.3×107 CFU/mL;2:6.3×106 CFU/mL;3:6.3×105 CFU/mL;4:6.3×104 CFU/mL;5:6.3×103 CFU/mL;6:6.3×102 CFU/mL;7:6.3×101 CFU/mL;8:陰性對照。

2.6 人工模擬樣品的多重PCR檢測

人工污染的新鮮萵苣過夜培養(yǎng)得到的均質(zhì)液濃度為7.8×107CFU/mL,經(jīng)10倍梯度稀釋后提取細菌DNA,應(yīng)用本研究建立的多重PCR方法進行檢測后,結(jié)果顯示(圖8),檢出限為7.8×104CFU/mL。

圖8 人工污染萵苣樣品的檢出限檢測結(jié)果Fig.8 The sensitivity of detection of artificial lettuce infected with two pathogens注:M:Marker;1:7.8×107 CFU/mL;2:7.8×106 CFU/mL;3:7.8×105 CFU/mL;4:7.8×104 CFU/mL;5:7.8×103 CFU/mL;6:7.8×102 CFU/mL;7:7.8×101 CFU/mL;8:陰性對照。

3 結(jié)論與討論

在目前的研究中,應(yīng)用多重PCR檢測技術(shù)快速檢測不同種類食源性致病菌的研究較廣泛[12-14],但是針對不同血清型的致瀉性大腸桿菌的快速檢測技術(shù)研究較匱乏,并且由于不同血清型致瀉性大腸桿菌的培養(yǎng)特性、生化特性相似,抗原性多有交叉,因此從分子的角度對不同血清型致瀉性大腸桿菌進行鑒定無疑是最可靠、最有效的檢測手段之一。張鐵男[15]等人對ETEC、EPEC、EIEC三種致瀉性大腸桿菌應(yīng)用多重PCR方法進行檢測;潘勁草[16]等人應(yīng)用多重PCR方法對EHEC和EPEC的多種毒力基因進行了檢測。

然而,在多重PCR反應(yīng)中存在著許多影響因素,各引物的特異性、穩(wěn)定性就是影響因素之一,因此合理設(shè)計引物、優(yōu)化反應(yīng)體系中不同引物濃度就十分重要。本研究針對兩種致瀉大腸埃希氏菌特異的毒力基因和大腸桿菌共有的毒力基因,設(shè)計了三對引物,在反應(yīng)中由O-antigen基因和uidA基因的引物共同鑒定EHEC O157∶H7,由ipaH基因和uidA基因的引物共同鑒定EIEC,避免了將此兩種菌錯誤鑒定為其他的食源性致病菌,特別是其他血清型的致瀉大腸桿菌。本研究還對引物添加量進行了正交優(yōu)化,使不同的引物組合更加全面,得到的最適引物添加量組合更加合理,避免了因引物濃度過高產(chǎn)生的錯配及非特異性擴增,也避免了因引物濃度過低使擴增產(chǎn)物太少而造成的假陰性。賀晨[17]等人應(yīng)用正交實驗對多重PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化,多重PCR反應(yīng)效果良好。另外,本研究還對建立的多重PCR反應(yīng)進行了準確性驗證,旨在驗證引物的穩(wěn)定性和特異性,避免因反應(yīng)內(nèi)部產(chǎn)生錯配而引起的非特異性擴增、假陽性和假陰性現(xiàn)象,結(jié)果證明引物穩(wěn)定性和特異性良好。

過高的Mg2+濃度和rTaq酶濃度、過低的退火溫度都會加大非特異性擴增產(chǎn)生的幾率[18],因此本研究選擇這三項對多重PCR反應(yīng)影響較大的因素進行優(yōu)化實驗,能夠使所建立的多重PCR反應(yīng)以最適的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對兩種致瀉性大腸桿菌進行檢測。此外,在前期實驗中,對延伸時間和循環(huán)數(shù)也進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)這兩項因素對本研究基本沒有影響,因此在反應(yīng)條件中只選擇對退火溫度進行優(yōu)化。

本研究建立的檢測EHEC O157∶H7和EIEC的多重PCR方法檢出限為6.3×103CFU/mL,說明建立的方法靈敏度良好,這個結(jié)果與賀晨[17]、孟慶美[19]和Rachel Binet[6]等建立的多重PCR檢測方法靈敏度接近,高于趙紅慶[20]和舒暢[21]等人建立的多重PCR方法的靈敏度,低于董伯森[18]等人將FTA 濾膜法與多重PCR方法結(jié)合檢測致病菌的檢出限。這可能是由于不同方法所應(yīng)用的DNA提取方法不同、不同細菌模板DNA或引物之間相互抑制作用、擴增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的參數(shù)不同等原因,造成了靈敏度上的差異。

影響多重PCR反應(yīng)的因素之一還有細菌的培養(yǎng)環(huán)境、模板DNA的含量和質(zhì)量等,翁思聰[22]等人應(yīng)用復(fù)合型増菌培養(yǎng)基,減少了培養(yǎng)基對PCR檢測的影響;郝玉芹[23]等人應(yīng)用FTA濾膜提取模板DNA,有效提高了靈敏度。本研究中檢測人工模擬樣品的檢出限高于只檢測標準菌株的檢出限,是由于果蔬中的成分會對細菌模板DNA的提取造成干擾,使模板DNA的含量、純度等指標降低,從而影響多重PCR反應(yīng)[21],因此在下一步研究中,應(yīng)將重心放在對樣品的增菌培養(yǎng)、菌體富集或模板DNA提取方法的研究中,以獲得特異性強、靈敏度高、針對性強的多重PCR檢測技術(shù)。

[1]王乃福,吳冬雪,張霞,等.致瀉性大腸桿菌基因芯片檢測方法的建立[J].食品研究與開發(fā),2014,35(7):5-9.

[2]蔣原.食源性病原微生物檢測指南[M].北京:中國標準出版社,2010.77-79.

[3]徐君怡,曹際娟,鄭秋月,等.變性高效液相色譜檢測食品中致瀉性大腸桿菌[J].微生物學(xué)報,2008,48(11):1526-1531.

[4]Fakruddin M D,Sultana M,Ahmed M M,et al. Multiplex PCR(polymerase chain reaction)assay for detection ofE.coliO157∶H7,Salmonellasp.,Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus in spiked shrimps(Penaeus monodon)[J]. Pakistan journal of biological sciences:PJBS,2013,16(6):267-274.

[5]李睿,張忠美,戴詩皎,等.食品中大腸桿菌O157的PCR檢測與wzy基因的測序分析[J].食品科學(xué),2010,31(12):193-196.

[6]Binet R,Deer D M,Uhlfelder S J. Rapid detection of Shigella and EnteroinvasiveEscherichiacoliin produce enrichments by a conventional multiplex PCR assay[J]. Food Microbiology,2014,40(2):48-54.

[7]郝江燕,胡文忠,何煜波,等.鮮活農(nóng)產(chǎn)品中大腸桿菌的PCR檢測[J].食品工業(yè)科技,2013,34(17):150-153.

[8]劉志杰,李如舉,曾智勇,等.多重PCR反應(yīng)的影響因素及其優(yōu)化[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011(7):26-28.

[9]呂曉萌,胡文忠,馮敘橋,等.PCR法檢測大腸桿菌的增殖條件優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(17):134-136.

[10]王慧,朱瑞良,譚燕玲,等.多重PCR檢測三種重要食源性致病菌方法的建立及應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(11):2334-2340.

[11]吳建英,宋建新,曹金萍,等.多重PCR快速檢測3種食源性致病菌[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2014,32(2):146-149.

[12]Son I,Binet R,Maounounen-Laasri A,et al. Detection of five Shiga toxin-producingEscherichiacoligenes with multiplex PCR[J]. Food Microbiology,2014,40(3):31-40.

[13]Gordillo R,Rodríguez A,Werning M L,et al. Quantification of viable Escherichia coli O157∶H7 in meat products by duplex real-time PCR assays[J]. Meat Science,2014,96(2):964-970.

[14]Kumar A,Grover S,Kumar Batish V. Application of multiplex PCR assay based on uidR and fliCH7 genes for detection ofEscherichiacoliO157∶H7 in milk[J]. The Journal of general and applied microbiology,2013,59(1):11-19.

[15]張鐵男,李繼昌,魯成武,等.3種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測方法的研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43(9):17-19.

[16]潘勁草,邵浙新.多重PCR方法檢測EHEC和EPEC毒力基因[J].中國人獸共患病雜志,2001,17(1):52-55.

[17]賀晨,孫鴻燕,邵麗筠,等. 4種病原菌多重PCR檢測方法建立[J].中國公共衛(wèi)生,2011,27(4):525-527.

[18]董伯森,楊國興,井官軍,等.利用多重 PCR 檢測3種食源性致病菌[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2014,30(8):41.

[19]孟慶美,王少輝,韓先干,等.禽致病性大腸桿菌毒力基因多重PCR方法的建立和應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,2014,54(6):696-702.

[20]趙紅慶,苑錫銅,王玉飛,等.多重PCR檢測致腹瀉大腸埃希菌方法的建立[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2009,19(10):2223-2226.

[21]舒暢,姜琛璐,鐘慈平,等.三種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2014,35(12):49-54.

[22]翁思聰,朱軍莉,馮立芳,等. 1種選擇性富集沙門氏菌,志賀氏菌,金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培養(yǎng)基SSSV研究[J].中國食品學(xué)報,2013,13(1):19-28.

[23]郝玉芹,孫皆宜,李艾,等. 正交優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系檢測3種食源性致病菌的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(2):602-605.

Establishment of a multiplex PCR method for rapid detection of two kinds of diarrheagenicEscherichiacoli

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,HE Yu-bo2,JIANG Ai-li2,FENG Ke3,LI Xiao-bo2

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

To establish a rapid multiplex PCR method,which can simultaneously detectEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7 andEnteroinvasiveEscherichiacoli,three pairs of primers had been designed based on theO-antigengene inEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7,ipaHgene inEnteroinvasiveEscherichiacolianduidAgene in allEscherichiacoli. The method was established and optimized,and the specificity and sensitivity were also analyzed. This method was applied to the detection of the artificially infected fresh lettuce with two pathogens. The results showed that the triplex PCR could detect two kinds of diarrheagenicEscherichiacoli. The sensitivity was 6.3×103CFU/mL. This method had high specificity and sensitivity. The sensitivity of the detection of artificial lettuce infected with two pathogens was 7.8×104CFU/mL. It was suggested that the method was suitable for rapid detection ofEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7 andEnteroinvasiveEscherichiacoliin fresh agricultural products.

multiplex PCR;rapid detection;EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7;EnteroinvasiveEscherichiacoli.

2015-01-28

董妍(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：食品安全，E-mail：dong_yan@126.com。

*通訊作者:胡文忠(1959- )，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；國家自然科學(xué)基金項目(31172009)；大連科技計劃項目(2012E13SF106)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0312-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.056