徐 兵,鄭麗雪,翁渝潔,冀 宏

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

常熟虞山松蕈優(yōu)良菌株選育及深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

徐 兵,鄭麗雪,翁渝潔,冀 宏*

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

針對(duì)常熟虞山松蕈菌株篩選及深層發(fā)酵條件優(yōu)化展開(kāi)研究。以松蕈深層液體發(fā)酵的生物量、菌絲球直徑、菌絲體密度及菌絲體日生長(zhǎng)速率為指標(biāo),篩選得到松蕈2號(hào)菌株。進(jìn)一步優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵周期對(duì)松蕈深層發(fā)酵的影響。最后,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d。在此條件下培養(yǎng)后,松蕈菌絲體干重達(dá)14.5 mg/mL。

虞山松蕈,菌株篩選,深層發(fā)酵,優(yōu)化

松蕈,即松茸,屬于真菌門,擔(dān)子菌亞門,層菌綱,傘菌目,口磨科,口磨屬[1],是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。常熟地區(qū)虞山自古以來(lái)自然環(huán)境使然,適者生存,松林的空氣中就含有蕈的孢子,當(dāng)溫濕度條件適宜時(shí),就會(huì)生長(zhǎng)出松蕈子實(shí)體。虞山蕈油面是江蘇常熟漢族傳統(tǒng)的特色面點(diǎn),有“素中之王”之稱,用蕈油作為面“澆頭”的蕈油面,鮮美異常,非一般蘑菇可比。經(jīng)研究表明,松蕈含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、人體必需氨基酸及多糖,其中松蕈多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用、抗衰老、抗輻射、抗糖尿病、美白、抗炎抗菌等作用[2-6]。食用菌的栽培工藝主要是采用固體菌種技術(shù),采用固體菌種技術(shù)已培育出多種食用菌,但固體栽培受到季節(jié)、原材料、生長(zhǎng)周期、成本和易污染等限制。實(shí)踐證明,食用菌深層液體發(fā)酵工藝制備液體菌種可替代固體菌種用于生產(chǎn)[7],采用深層發(fā)酵工藝制備食用菌液體菌種是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前,還未見(jiàn)關(guān)于人工固體栽培松樹(shù)蕈及深層液體發(fā)酵工藝制備液體菌種方面的研究。

本文針對(duì)常熟虞山松蕈菌株篩選及深層發(fā)酵條件優(yōu)化展開(kāi)研究,旨在為實(shí)現(xiàn)松蕈的工廠化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松蕈 江蘇常熟虞山,6個(gè)松蕈子實(shí)體分別編號(hào)為松蕈1號(hào),松蕈2號(hào),松蕈3號(hào),松蕈4號(hào),松蕈5號(hào),松蕈6號(hào)。

5418R型小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) eppendorf中國(guó)有限公司;MJ-250BS-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;WGL-45B型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;GHP-9160型隔水式培養(yǎng)箱 上海申賢恒溫設(shè)備廠;M124A型電子天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司;ZQLY-180型全溫震蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器;CJ-1S型潔凈工作臺(tái) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種選育培養(yǎng)基制備 固體培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,胰蛋白胨4 g,磷酸二氫鉀3 g,硫酸鎂1.5 g,VB10.002 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)基制備 液體培養(yǎng)基:葡萄糖30 g,酵母粉5 g,磷酸二氫鉀3.5 g,硫酸鎂1.5 g,VB10.002 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.2.3 種子液的制備 無(wú)菌操作條件下,取活化好的1 cm×1 cm菌種塊于三角瓶液體培養(yǎng)基中,每瓶接種3塊,于26 ℃,160 r/min條件下培養(yǎng)9 d。三角瓶裝液量為100 mL/250 mL。

1.2.4 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 將松蕈種子液按照5%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于26 ℃、160 r/min,培養(yǎng)9 d。

1.2.5 優(yōu)良菌株篩選 在同等條件下,將6株野生松蕈菌種分別接入PDA培養(yǎng)基中,于26 ℃培養(yǎng)活化。然后將活化好的松蕈菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),考察菌絲球直徑、菌絲球數(shù)量、菌絲體干重及菌絲體日生長(zhǎng)速率4個(gè)指標(biāo),篩選出液體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株。

1.2.5.1 菌絲球直徑(d)的測(cè)定 隨機(jī)取菌絲球20個(gè),將其拍成一排,測(cè)量其總長(zhǎng)度,重復(fù)三次,取平均值,記為D,菌絲球直徑即d=D/20[8]。

1.2.5.2 菌絲球數(shù)量的測(cè)定 取10 mL的發(fā)酵液,過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩,計(jì)數(shù)篩網(wǎng)上的菌絲球的個(gè)數(shù),此數(shù)值記為n個(gè)。則100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)目為N=10×n。

1.2.5.3 菌絲體干重的測(cè)定 取100 mL發(fā)酵醪液于80目標(biāo)準(zhǔn)篩中過(guò)濾,用蒸餾水沖洗3次,將過(guò)濾所得的菌絲體于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,得松蕈菌絲體干重記為W。

1.2.5.4 菌絲體日生長(zhǎng)速率的測(cè)定 在同等條件下,將不同編號(hào)的松蕈菌種分別接入PDA培養(yǎng)基中,放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)置溫度為26 ℃。每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況,當(dāng)菌絲體開(kāi)始生長(zhǎng),每2 d在固定時(shí)間測(cè)定菌落直徑,連續(xù)測(cè)量5次,測(cè)量菌絲用十字交叉法。計(jì)算菌絲體日均生長(zhǎng)速率。計(jì)算公式如下:

式(1)

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 溫度對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 以菌絲體干重作為指標(biāo),考察不同溫度對(duì)松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。溫度分別設(shè)定為23、24、25、26、27 ℃。搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為9 d。

1.2.6.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 考察不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為120、140、160、180、200 r/min。溫度為25 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為9 d。

1.2.6.3 發(fā)酵周期對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 以菌絲體干重作為指標(biāo),考察發(fā)酵周期對(duì)松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。培養(yǎng)溫度為25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.2.7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken模型對(duì)影響松蕈菌絲體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素(溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期)進(jìn)行優(yōu)化。數(shù)據(jù)處理軟件為Design Expert 8.05 b。

設(shè)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期為自變量,分別為A,B,C,每個(gè)自變量中的低、中、高水平以-1,0,1進(jìn)行編碼,以菌絲體干重為因變量R進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 編碼與因子的實(shí)際濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良菌株篩選實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同編號(hào)松蕈菌絲球直徑測(cè)定結(jié)果 由圖1可知,不同編號(hào)松蕈菌絲球直徑由大到小依次為:松蕈2號(hào)>松蕈3號(hào)>松蕈4號(hào)>松蕈1號(hào)>松蕈5號(hào)>松蕈6號(hào)。其中松蕈2號(hào)菌絲球直徑和松蕈3號(hào)相差不大,分別為0.213 cm和0.208 cm。其他編號(hào)的松蕈菌絲球直徑均小于0.2 cm,對(duì)于液體發(fā)酵的菌絲球直徑一般要求在0.2 cm左右[9]。

圖1 不同編號(hào)菌株菌絲球直徑Fig.1 Different strains mycelium ball diameter

2.1.2 不同編號(hào)松蕈菌絲球數(shù)量的測(cè)定結(jié)果 100 mL發(fā)酵液中,不同編號(hào)松蕈菌絲球數(shù)量見(jiàn)圖2。由圖2可知,松蕈3號(hào)發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量最多,達(dá)到了2900個(gè),其次是松蕈2號(hào),每100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量為2880個(gè)。對(duì)于液體發(fā)酵的菌絲球數(shù)量要求在3000個(gè)/100 mL左右[9]。所以,基本能夠達(dá)到液態(tài)深層發(fā)酵要求的菌株是松蕈3號(hào)和松蕈2號(hào)。

圖2 不同編號(hào)菌株菌絲球數(shù)量Fig.2 Different strains mycelium ball numbers

2.1.3 不同編號(hào)松蕈菌絲體干重的測(cè)定結(jié)果 不同編號(hào)松蕈菌絲體干重如圖3所示,由圖3可知:松蕈2號(hào)菌絲體干重最大,為11.82 mg/mL,其次為松蕈3號(hào),菌絲體干重為10.92 mg/mL,松蕈6號(hào)菌絲體干重最小。

圖3 不同編號(hào)菌株菌絲體干重 Fig.3 Different strains dry weight of mycelium

2.1.4 菌絲體日生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果 由圖4可見(jiàn),2號(hào)和3號(hào)的菌絲體日均生長(zhǎng)速率最快,2號(hào)菌絲體日生長(zhǎng)速率為0.46 cm/d,特別是第10～12 d菌絲生長(zhǎng)速率大幅度提升,這可能由于此培養(yǎng)基適合2號(hào)、3號(hào)菌絲體生長(zhǎng),前期可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基松緊影響,菌絲體處于穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)期,后期當(dāng)培養(yǎng)基適宜菌絲體生長(zhǎng)后,速率大幅度提升。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌絲體日均生長(zhǎng)速率Fig.4 Day of mycelium growth rate under different culture time

綜合菌絲球直徑、數(shù)量、干重及日生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果,松蕈2號(hào)3號(hào)的測(cè)定結(jié)果相近,但是松蕈2號(hào)發(fā)酵液菌絲體干重大于松蕈3號(hào),所以,可初步判斷松蕈2號(hào)更適合液體發(fā)酵,本文選擇松蕈2號(hào)菌株作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 保持酶活一個(gè)重要因素就是溫度,因此,在發(fā)酵過(guò)程中,選擇最佳的溫度條件,使得酶能維持其活性,才能使微生物生長(zhǎng)保持在旺盛狀態(tài),得到最多的目的產(chǎn)物[10-11]。

不同發(fā)酵溫度對(duì)松蕈菌絲體產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.5 Effect of temperature on the mycelia of Tricholoma matsutake

由圖可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí),松蕈菌絲體干重最大,為13.2 mg/mL。當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí),松蕈菌絲體產(chǎn)量急劇下降,可能是松蕈菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶耐熱性差,酶活降低導(dǎo)致。因此,選擇25 ℃作為最佳的發(fā)酵溫度。

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 當(dāng)水中含有其他物質(zhì)的時(shí)候,氧在水中的溶解度就會(huì)降低。所以,在發(fā)酵的過(guò)程中,為滿足菌絲體生長(zhǎng)代謝的需要,需要不斷的向培養(yǎng)液供給足夠的氧,但是,當(dāng)溶氧過(guò)大的時(shí)候,菌絲體的生長(zhǎng)代謝又會(huì)受到抑制,因此,為了提高代謝產(chǎn)物的濃度只能保持合適的溶氧[12]。通過(guò)搖床轉(zhuǎn)速可控制培養(yǎng)基中氧的含量。

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松蕈產(chǎn)菌絲體的影響見(jiàn)圖6。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.6 Effect of shaking speed on the mycelia of Tricholoma matsutake

由圖6可知,搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松蕈產(chǎn)菌絲體的影響比較明顯,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí),發(fā)酵液中菌絲體產(chǎn)量最高。轉(zhuǎn)速低時(shí),由于通氣量小,培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧量不足,不能滿足菌絲體生長(zhǎng)需求,而轉(zhuǎn)速過(guò)高對(duì)菌絲球的剪切作用增強(qiáng),也不利于菌絲體的生長(zhǎng)[13]。所以選擇160 r/min為最佳的搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.3 發(fā)酵周期對(duì)虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 菌絲體的生長(zhǎng)分為遲滯期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,穩(wěn)定期及衰亡期四個(gè)時(shí)期。發(fā)酵周期對(duì)松蕈菌絲體產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵周期對(duì)松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.7 Effect of fermentation cycle on the mycelia of Tricholoma matsutake

從發(fā)酵第2 d開(kāi)始,菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,發(fā)酵第7 d,菌絲體產(chǎn)量接近最大,第8 d和第9 d時(shí)菌絲體產(chǎn)量相差不大?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)過(guò)程中菌絲球直徑增大,導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物和溶解氧向內(nèi)部傳遞困難,菌絲體量不再增加。所以,選擇8 d作為發(fā)酵周期。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。按照Design Expert 8.05 b軟件中的Box-Behnken Design方法,三個(gè)因素經(jīng)過(guò)擬合得到的回歸方程為:

菌絲體干重=13.42+0.12A+0.97B+1.60C-0.17AB+0.55AC+0.43BC-0.70A2-1.29B2-1.51C2

表3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)結(jié)果

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,該模型達(dá)到極顯著水平(p=0.0005<0.01),該模型的R2=0.9575,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好,故可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)。

由表4可知,在一次項(xiàng)中,搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期對(duì)松蕈菌絲體干重的影響顯著(p<0.05),溫度對(duì)于松蕈菌絲體干重的影響不顯著。在二次項(xiàng)中,溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期的影響都達(dá)到了顯著水平,交互項(xiàng)中,各因素的交互作用都不顯著。

根據(jù)Design Expert 8.05 b軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖如圖8～圖10所示,溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以從圖中直觀地反映出來(lái),并確定各個(gè)因素的最佳水平。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

圖8 溫度及搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松蕈菌絲體交互效應(yīng)的響應(yīng)面圖Fig.8 Rsponse surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs fermentation temperature and rotation speed

圖9 溫度及發(fā)酵周期對(duì)松蕈菌絲體交互效應(yīng)的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs fermentation temperature and fermentation cycle

通過(guò)分析預(yù)測(cè)得到松蕈菌絲體干重最大值為

圖10 搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵周期對(duì)松蕈菌絲體交互效應(yīng)的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs rotation speed and fermentation cycle

14.18 mg/mL,即當(dāng)A(溫度)=25.3 ℃,B(搖床轉(zhuǎn)速)=169.4 r/min,C(發(fā)酵周期)=8.7 d。考慮到實(shí)際操作便利,確定發(fā)酵條件的最佳組合為:溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d。為了證實(shí)預(yù)測(cè)的結(jié)果,用以上得到的最優(yōu)配方重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,3次實(shí)驗(yàn)菌絲體干重平均值為14.5 mg/mL,與預(yù)測(cè)值擬合較好,由此可以看出回歸方程為松蕈液體發(fā)酵提供了一個(gè)合適的模型。優(yōu)化后松蕈菌絲體產(chǎn)量與課題組前期優(yōu)化的白靈菇深層發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量接近,這說(shuō)明液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)松蕈將指日可待[14]。

3 結(jié)論

以菌絲球直徑、菌絲球數(shù)量、菌絲體干重及菌絲體日生長(zhǎng)速率為指標(biāo),篩選到液體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株為2號(hào)菌株,其菌絲球直徑為0.213 cm,每100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量為2880個(gè),菌絲體干重為11.82 mg/mL,菌絲體日生長(zhǎng)速率為0.46 cm/d。

由單因素實(shí)驗(yàn)可知,實(shí)驗(yàn)菌株液體發(fā)酵最佳溫度為25 ℃,最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,最佳發(fā)酵周期為8 d。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d,在此條件下,松蕈菌絲體干重為14.5 mg/mL,比優(yōu)化前提高了23%。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)常熟虞山松蕈菌絲體深層液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、容易獲取,而且發(fā)酵周期短,菌絲體產(chǎn)量可觀,此研究對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐具有較好的指導(dǎo)作用。

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Predominant strains breeding and optimization of submerged fermentation conditions of Changshu YushanTricholomamatsutake

XU Bing,ZHENG Li-xue,WENG Yu-jie,JI Hong*

(College of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Strains breeding and optimization of submerged fermentation conditions of Changshu YushanTricholomamatsutakewere studied in this paper. The predominant strain ofTricholomamatsutakein liquid culture was screened by testing mycelium ball diameter,mycelium ball number,mycelium dry weight of the ball and day of mycelium growth rate under different incubation time. NO.2 was used as experimental strains. Mycelium submerged fermentation culture conditions were optimized. The effect temperature,shaking speed and fermentation cycle onTricholomamatsutakesubmerged fermentation were researched by single factor experiment. The optimal fermentation conditions determined by the response surface test was 25 ℃,170 r/min and 8.5 d,under which the dry weight of mycelium was 14.5 mg/mL.

Tricholomamatsutakeof Yushan;strains breeding;submerged fermentation;optimization

2015-01-26

徐兵(1982-)，男，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食用菌工程技術(shù)，E-mail：xubing@cslg.cn。

*通訊作者:冀宏(1969-)，男，博士研究生，研究員，研究方向：食用菌工程技術(shù)，E-mail：jihong@cslg.cn。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.033