林艷秋, 彭江濤, 官華忠, 侯新坡, 陳志偉, 朱秀鳳, 黃榮德, 周元昌

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

水稻稻瘟病抗病基因Pi-1和Pi-9雙重PCR檢測體系的建立

林艷秋, 彭江濤, 官華忠, 侯新坡, 陳志偉, 朱秀鳳, 黃榮德, 周元昌

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

利用分別與抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-9緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766和SNP標(biāo)記FP1+FP2+RP組成雙重PCR體系，通過設(shè)置Mg2+、dNTPs和引物濃度梯度，探索雙重PCR體系中各反應(yīng)物的使用量，由此確定最優(yōu)雙重PCR反應(yīng)體系.在水稻恢復(fù)系R1059與R673雜交的BC3F2群體中隨機(jī)挑選20個單株對該雙重PCR反應(yīng)體系的效果進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果表明，20個單株的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果與2個單一PCR擴(kuò)增結(jié)果相符，并且條帶清晰，說明該雙重PCR反應(yīng)體系在利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因聚合上可提高選擇效率和減少費(fèi)用.

雙重PCR; 反應(yīng)劑濃度; 擴(kuò)增效果

Chambercian et al[1]在1988年首次提出多重PCR(mutiplex PCR)，即在單一反應(yīng)體系中同時加入兩對或兩對以上的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增多個序列的反應(yīng)過程.多重PCR具有高效率、高產(chǎn)率、高度特異敏感、減少實(shí)驗(yàn)成本、加快試驗(yàn)進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)，所以自從它誕生后就得到了飛速發(fā)展并廣泛應(yīng)用[2,3].其技術(shù)原理與單一PCR相同，主要區(qū)別在于多重PCR技術(shù)加入兩對或兩對以上的特異引物對到單一反應(yīng)體系中，因而可以同時在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增出兩條或兩條以上的目的DNA片段.由于各種生物體基因組出現(xiàn)連續(xù)20-30個堿基完全相同的可能性極小，因而與單個引物對特異互補(bǔ)的模板是高度保守的，同時DNA聚合酶具有極高的復(fù)制準(zhǔn)確性，所以由引物交叉結(jié)合而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增在多重PCR反應(yīng)體系中出現(xiàn)的可能性很小，保證了多重PCR的特異性和敏感性.因此，理論上只要條件符合，多重PCR中引物對的數(shù)量是可以不限的，可同時擴(kuò)增幾條目的DNA片段，從而減少了試驗(yàn)成本和加快試驗(yàn)進(jìn)程等.

目前，多重PCR在病原體鑒別、性別篩選、連鎖分析、法醫(yī)研究、模板定量和遺傳疾病診斷等方面應(yīng)用較多[4-9].在植物生物學(xué)方面，主要應(yīng)用于檢測植物病蟲害、植物分子育種和植物種質(zhì)純度鑒定等方面[10].但近年來，也有令人鼓舞的應(yīng)用報(bào)道，例如Ma et al[11]利用三重PCR(3個引物對分別對應(yīng)小麥的3個染色體組)對50個澳大利亞主栽小麥品種進(jìn)行了高分子量麥谷蛋白亞基分析，結(jié)果表明，大多數(shù)情況下，高分子質(zhì)量的麥谷蛋白亞基可被同時鑒定，并發(fā)現(xiàn)2個品種的高分子質(zhì)量的麥谷蛋白亞基與前人測定存在差異.該研究結(jié)果證明了采用多重PCR反應(yīng)體系不僅減少試驗(yàn)費(fèi)用，而且縮短了時間，加快試驗(yàn)進(jìn)程.另外，我國的育種家利用多重PCR篩選育種材料也有不少收獲.易繼財(cái)?shù)萚12]利用多重PCR對空間搭載誘導(dǎo)水稻種子發(fā)生的突變進(jìn)行分子檢測，檢測出SJ突變體的缺失，同時發(fā)現(xiàn)其大片段的缺失比例與LET及劑量有關(guān).

隨著研究的深入，多重PCR在植物生物學(xué)的各個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.如植物分子育種、基因表達(dá)研究、種質(zhì)純度鑒定、病蟲害檢測等方面，并逐漸成為重要且有效的研究方法.Pi-1與Pi-9均是對稻瘟病具有廣譜抗性的顯性基因，本研究是將與Pi-1緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766和與Pi-9緊密連鎖的SNP標(biāo)記FP1+FP2+RP組成雙重PCR(double PCR, DPCR)，探索適合的DPCR反應(yīng)體系，建立準(zhǔn)確、高效、快速的分析技術(shù)，為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

水稻恢復(fù)系R1059、R673以及R1059與R673回交的BC3F2群體.

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用SDS小量提取法，提取供試材料幼嫩葉片DNA.提取方法參照段遠(yuǎn)霖等[13]方法.

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參考陳志偉等[14]報(bào)道的與Pi-1基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766，其中MRG4766上游引物序列為：5′-ATT GCT GCA AAG TGG GAG AC-3′，下游引物序列為：5′-AAG TGG AGG CAG TTC ACC AC-3′.另外，與Pi-9基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記FP1+FP2+RP引物序列分別為：FP1：5′-TCC CTG ATT CCA ACC TGC AGC AAG AG-3′；FP2：5′-CCA ACC TGC ACC AGC CT-3′；RP：5′-CCA TGC TGA TAC TTG GGG CA-3′[15].

1.2.3 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng) 由于本實(shí)驗(yàn)采用兩對引物的退火溫度均為60 ℃，故以此溫度為擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度.單一引物FP1+FP2+RP的PCR反應(yīng)體系為15 μL，含Sterile water 6.7 μL、FP1 0.6 μL、FP2 1.2 μL、RP1.2 μL、10×buffer 1.5 μL、Mg2+1.5 μL、dNTPs 0.2 μL、5UTap酶0.1 μL、20 ng·μL-1DNA 2 μL，終濃度分別是FP1為0.16 μmol·L-1、FP2 0.32 μmol·L-1、RP0.32 μmol·L-1、buffer為1×buffer、Mg2+為2.5 mmol·L-1、dNTPs為0.13 mmol·L-1、Tap酶為0.033 U·μL-1、DNA為2.67 ng·μL-1；單一引物MRG4766的PCR反應(yīng)體系為15 μL，含Sterile water 8.2 μL、MRG4766 1.5 μL、10×buffer 1.5 μL、Mg2+1.5 μL、dNTPs 0.2 μL、5UTap酶0.1 μL、20 ng·μL-1DNA 2 μL，終濃度分別是MRG4766為0.4 μmol·L-1、buffer為1×buffer、Mg2+為2.5 mmol·L-1、dNTPs為0.13 mmol·L-1、Tap酶為0.033 U·μL-1、DNA為2.67 ng·μL-1.通過除了buffer、Tap酶、DNA的濃度不變外，分別設(shè)置Mg2+、dNTPs和混合引物FP1+FP2+RP、MRG4766(混合引物間的比例不變)的5個濃度梯度，以其中一個反應(yīng)物為變量，其余反應(yīng)物的濃度不變，探索雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件.Mg2+的5個終濃度梯度分別為0.83、1.67、2.50、3.33、4.17 mmol·L-1；dNTPs的5個濃度梯度分別為0.07、0.10、0.13、0.17、0.20 mmol·L-1；混合引物FP1+FP2+RP、MRG4766的5個濃度梯度分別為0.11、0.21、0.21、0.27 μmol·L-1，0.13、0.27、0.27、0.33 μmol·L-1，0.16、0.32、0.32、0.40 μmol·L-1，0.19、0.37、0.37、0.47 μmol·L-1，0.21、0.43、0.43、0.53 μmol·L-1.具體方法見文獻(xiàn)[16].

PCR程序：第1步94 ℃預(yù)變性4 min；第2步94 ℃變性30 s；第3步60 ℃退火30 s；第4步72 ℃延伸30 s；第2步到第4步循環(huán)34次；72 ℃終延伸10 min后4 ℃保存.反應(yīng)在Eppendorf AG擴(kuò)增儀上進(jìn)行.

1.2.4 電泳 通過6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.2.5 銀染 電泳結(jié)束后，將取出的凝膠放入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%酒精與500 μL冰乙酸的混合溶液中固定5 min，再加入500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% AgNO3溶液染色5-8 min，用蒸餾水漂洗2次，最后放入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaOH與500 μL甲醛的混合溶液中顯影，觀察擴(kuò)增結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 Mg2+適宜反應(yīng)濃度的確定

Mg2+濃度通過影響聚合酶的活性，使PCR的擴(kuò)增效率產(chǎn)生變化，濃度過高會產(chǎn)生非特異性條帶，影響觀察效果，濃度過低則會降低PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使擴(kuò)增失敗.在本次試驗(yàn)設(shè)置5個Mg2+濃度梯度(0.83、1.67、2.5、3.33、4.17 mmol·L-1)，結(jié)果表明，Mg2+終濃度為3.33和4.17 mmol·L-1的DPCR反應(yīng)擴(kuò)增的條帶清晰、效果較好，且無顯著差異(圖1).從節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本出發(fā)，故確定3.33 mmol·L-1濃度為雙重PCR的適宜Mg2+反應(yīng)濃度.

上部分泳帶為FP1+FP2+RP擴(kuò)增的產(chǎn)物，下部分泳帶為MRG4766擴(kuò)增的產(chǎn)物；1、3、5、7、9泳道均為R1059，2、4、6、8、10泳道均為R463； 1、2泳道Mg2+濃度為0.83 mmol·L-1，3、4泳道Mg2+濃度為1.67 mmol·L-1，5、6泳道Mg2+濃度為2.5 mmol·L-1， 7、8泳道Mg2+濃度為3.33 mmol·L-1，9、10泳道Mg2+濃度為4.17 mmol·L-1.圖1 不同Mg2+濃度梯度下的DPCR擴(kuò)增效果Fig.1 DPCR amplification results in different Mg2+ concentrations

2.2 dNTPs適宜反應(yīng)濃度的確定

dNTPs是PCR的原料，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度太低會降低擴(kuò)增的產(chǎn)量.本試驗(yàn)設(shè)置五個dNTPs濃度梯度(0.07、0.10、0.13、0.17、0.20 mmol·L-1)，結(jié)果表明，dNTPs終濃度為0.17和0.20 mmol·L-1時，DPCR的擴(kuò)增條帶清晰、效果較好，且無明顯差異(圖2)，故確定0.17 mmol·L-1濃度為雙重PCR的適宜dNTPs反應(yīng)濃度.

上部分泳帶為FP1+FP2+RP擴(kuò)增的產(chǎn)物，下部分泳帶為MRG4766擴(kuò)增的產(chǎn)物；1、3、5、7、9泳道均為R1059，2、4、6、8、10泳道均為R463； 1、2泳道dNTPs濃度為0.07 mmol·L-1，3、4泳道dNTPs濃度為0.10 mmol·L-1，5、6泳道dNTPs濃度為0.13 mmol·L-1， 7、8泳道dNTPs濃度為0.17 mmol·L-1，9、10泳道dNTPs濃度為0.20 mmol·L-1.圖2 不同dNTPs濃度梯度下的DPCR擴(kuò)增效果Fig.2 DPCR amplification results in different dNTPs concentrations

2.3 引物適宜反應(yīng)濃度的確定

引物做為PCR反應(yīng)的主要成分，其濃度過高易發(fā)生錯配和產(chǎn)生引物二聚體，過低直接影響擴(kuò)增產(chǎn)量.本試驗(yàn)設(shè)置5個不變混合引物濃度梯度(引物間的比例不變).結(jié)果表明，當(dāng)混合引物FP1、FP2、RP、MRG4766終濃度為0.16、0.32、0.32、0.40 μmol·L-1， 0.19、 0.37、0.37、0.47 μmol·L-1和0.21、0.43、0.43、0.53 μmol·L-1時，其條帶清晰、穩(wěn)定，擴(kuò)增效果較好，且無明顯差異(圖3).為了節(jié)省材料，因此確定混合引物FP1、FP2、RP、MRG4766適宜引物反應(yīng)濃度為0.16、0.32、0.32、0.40 μmol·L-1.

2.4 驗(yàn)證反應(yīng)體系

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果擬確定DPCR反應(yīng)體系，具體反應(yīng)體系15 μL，含Sterile water 4.65 μL、FP1 0.6 μL、FP2 1.2 μL、RP1.2 μL、10×buffer 1.5 μL、Mg2+2.0 μL、dNTPs 0.25 μL、5UTap酶 0.1 μL、20 ng·μL-1DNA 2 μL，終濃度分別是FP1為0.16 μmol·L-1、FP2 0.32 μmol·L-1、RP0.32 μmol·L-1、MRG4766 0.4 μmol·L-1、buffer為1×buffer、Mg2+為3.33 mmol·L-1、dNTPs為0.17 mmol·L-1、Tap酶為0.033 U·μL-1、DNA為2.67 ng·μL-1.

上部分泳帶為FP1+FP2+RP擴(kuò)增的產(chǎn)物，下部分泳帶為MRG4766擴(kuò)增的產(chǎn)物；1、3、5、7、9泳道均為R1059，2、4、6、8、10泳道均為R463； 1、2泳道FP1+FP2+RP、MRG4766濃度為0.11、0.21、0.21 、0.27 μmol·L-1，3、4泳道FP1+FP2+RP、MRG4766濃度為0.13、0.27、 0.27、0.33 μmol·L-1，5、6泳道FP1+FP2+RP、MRG4766濃度為0.16、0.32、0.32、0.40 μmol·L-1，7、8泳道FP1+FP2+RP、 MRG4766濃度為0.19、0.37、0.37、0.47 μmol·L-1，9、10泳道FP1+FP2+RP、MRG4766濃度為0.21、0.43、0.43、0.53 μmol·L-1.圖3 引物對間比例不變條件下混合引物濃度對DPCR擴(kuò)增效果的影響Fig.3 Effects of different mixed primers concentrations on DPCR amplification results under the condition of the invariant proportion of primers

在R1059與R673雜交后代BC3F2群體中隨機(jī)挑選20株單株進(jìn)行驗(yàn)證，圖4為FP1、FP2、RP與MRG4766的雙重PCR擴(kuò)增效果，圖5為單一引物FP1+FP2+RP的PCR擴(kuò)增效果，圖6為單一引物MRG4766的PCR擴(kuò)增效果，雙重PCR的檢查結(jié)果與單一PCR的擴(kuò)增結(jié)果一致，說明可以將擬確定的雙重PCR反應(yīng)體系用于Pi-1和Pi-9基因聚合的標(biāo)記輔助育種中，以減輕工作量.

上部分泳帶為FP1+FP2+RP擴(kuò)增的產(chǎn)物，下部分泳帶為MRG4766擴(kuò)增的產(chǎn)物；泳道9為R1059，泳道10為R673， 其余泳道為R1059與R673的BC3F2單株；M：100bp DNA Ladder.圖4 BC3F2單株的DPCR擴(kuò)增效果Fig.4 DPCR amplification results of BC3F2 populations

泳道9為R1059，泳道10為R673，其余泳道為R1059與R673的BC3F2單株；M：100bp DNA Ladder.圖5 BC3F2單株的FP1+FP2+RP單一PCR擴(kuò)增效果Fig.5 FP1+FP2+RP single PCR amplification results of BC3F2 populations

泳道9為R1059，泳道10為R673，其余泳道為R1059與R673的BC3F2單株；M：100 bp DNA Ladder.圖6 BC3F2單株的MRG4766單一PCR擴(kuò)增效果Fig.6 MRG4766 single PCR amplification results of BC3F2 populations

3 討論

單一PCR擴(kuò)增方法僅能擴(kuò)增1個目的基因片段，因此檢測不同的目的基因需要重復(fù)配置PCR反應(yīng)液.而多重PCR通過優(yōu)化單一PCR的反應(yīng)體系，加入兩對或兩對以上的特異引物對到同一個反應(yīng)體系中，便可檢測多個目的基因.

為了提高水稻分子標(biāo)記輔助育種效率，本次研究將與Pi-1緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766和與Pi-9緊密連鎖的SNP標(biāo)記FP1+FP2+RP組成雙重PCR，設(shè)置Mg2+、dNTPs和引物濃度梯度，探索雙重PCR體系中各反應(yīng)物的使用量，并擬確定雙重PCR反應(yīng)體系為15 μL，含4.65 μL Sterile water、1.5 μL 10×buffer、2.0 μL 25 μmol·L-1Mg2+、0.25 μL 10 mmol·L-1dNTPs、1.5 μL 4 μmol·L-1MRG4766、0.6 μL 4 μmol·L-1FP1、1.2 μL 4 μmol·L-1FP2、1.2 μL 4 μmol·L-1RP、0.1 μL 5 UTap酶、2.0 μL 20 ng·μL-1模板DNA，終濃度分別是FP1為0.16 μmol·L-1、FP2 0.32 μmol·L-1、RP0.32 μmol·L-1、MRG4766 0.4 μmol·L-1、buffer為1×buffer、Mg2+為3.33 mmol·L-1、dNTPs為0.17 mmol·L-1、Tap酶為0.033 U·μL-1、DNA為2.67 ng·μL-1.在水稻R1059與R673的雜交后代BC3F2群體中隨機(jī)挑選20株單株對探索的擬確定反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果表明，隨機(jī)挑選的20株單株的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果與兩個單一PCR擴(kuò)增結(jié)果相符，并且條帶清晰、穩(wěn)定，說明本次試驗(yàn)探索的雙重PCR反應(yīng)體系可以用于Pi-1和Pi-9基因聚合的標(biāo)記輔助選擇育種中，提高育種選擇效率以及減少試驗(yàn)成本.另外，在本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同類型的分子標(biāo)記可以混合進(jìn)行多重PCR.

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Establishment of double PCR detection system for rice blast resistancegenesPi-1 andPi-9

LIN Yan-qiu, PENG Jiang-tao, GUAN Hua-zhong, HOU Xin-po, CHEN Zhi-wei,ZHU Xiu-feng, HUANG Rong-de, ZHOU Yuan-chang

(Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou, Fujian 350002, China)

For the purpose of improving the efficiency of molecular maker-assisted selection, a double PCR (DPCR) system with a SSR marker MRG4766 closely linked to the rice blast-resistant genePi-1 and a SNP markerFP1+FP2+RPclosely linked to the rice blast-resistant genePi-9 was established by setting the Mg2+, dNTPs and primers concentration gradients. 20 plants derived from rice restorer lines R1059/R673//R1059 BC3F2populations were selected to verify the effect of the DPCR system. The results showed that the stripes by means of the DPCR amplification were clear and were consistent with those by using of two single PCR, respectively. It was indicated that the application of the DPCR system in pyramiding genes could improve breeding selection efficiency and reduce cost.

double PCR; concentration of reactants; amplification result

2014-05-07

2014-08-27

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2013BAD01B0107);福建省科技廳科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2012N0007);福建省自然科學(xué)基金(2012J01091).

林艷秋(1990-)，女，碩士.研究方向：水稻遺傳育種.Email:linyanqiu116@126.com.通訊作者周元昌(1963-)，男，研究方向：水稻遺傳育種.Email:zwy_2002@163.com.

S511

A

1671-5470(2015)02-0169-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.011