周 密，李 哲，王艷艷

（1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春130031；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科）

柯薩奇病毒感染所致小鼠胰腺組織損傷

周 密1，李 哲2，王艷艷3

（1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春130031；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科）

目的研究柯薩奇病毒感染與胰島素依賴性糖尿病之間的關(guān)系。方法 采用人腸道病毒B組中柯薩奇B4病毒株感染小鼠，檢測感染后小鼠胰腺組織病毒滴度、病理變化、糖耐量及胰島素分泌情況。結(jié)果 病毒感染組小鼠胰腺組織病毒滴度比心肌組織和血清病毒滴度高，胰腺外分泌部破壞、胰島萎縮；免疫組化分析顯示胰島素分泌量減少；小鼠糖耐量異常。結(jié)論 柯薩奇B4病毒感染可導(dǎo)致小鼠胰腺損傷，功能異常。

柯薩奇病毒；胰腺；胰島素

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1615）

Ⅰ型糖尿?。═ype 1diabetes mellitus，T1D）是由于胰腺分泌胰島素的β細(xì)胞受損而導(dǎo)致的內(nèi)分泌代謝疾病。近年研究表明，除遺傳因素外，病毒感染等環(huán)境因素也是T1D發(fā)生的潛在致病因素。對相關(guān)問題的探討已經(jīng)成為研究I型糖尿病發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)［1］。病毒感染機(jī)制研究表明腸道病毒［2］感染，尤其是柯薩奇B組病毒（Coxsackievirus B，CVB）與I型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)［3，4］，國外的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在T1D患者中人類腸道病毒RNA的檢出率高于未患糖尿病者［5，6］，并對分離自當(dāng)?shù)靥悄虿』颊叩娜祟惸c道病毒株進(jìn)行實驗研究，發(fā)現(xiàn)某些人類腸道病毒株（尤其是柯薩奇B組病毒）在體內(nèi)外均能導(dǎo)致胰島分泌功能障礙［3，4］。但由于人類腸道病毒的種類繁多，且致病譜廣泛，尚不能確定哪些種類與T1D相關(guān)以及病毒在其中的作用機(jī)制。為進(jìn)一步研究我國的柯薩奇B組病毒感染與T1D發(fā)生的關(guān)系，本研究采用我國流行CVB4株感染小鼠，并對感染小鼠血液及胰腺組織中病毒滴度、病理變化、糖耐量水平及胰島素的變化進(jìn)行動態(tài)觀察，探討柯薩奇病毒感染與I型糖尿病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ICR小鼠，雄性，3－4wk齡，18－22 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試劑 細(xì)胞營養(yǎng)液為美國Sigma產(chǎn)品；胰蛋白酶、新生牛血清為Hyclone產(chǎn)品；胰島素抗體為BioChemicon產(chǎn)品，免疫組化試劑為福州邁新生物公司產(chǎn)品。血糖檢測試劑為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞及病毒株 在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增柯薩奇B4病毒，滴定病毒的50%組織細(xì)胞感染量（TCID50／ml），按Reed－Muench法計算為10－7，細(xì)胞和病毒由吉林大學(xué)病原實驗室保存。

1.4 實驗動物病毒感染 小鼠隨機(jī)分為感染組（1－6組）和對照組（1－6組），每組10只，飼養(yǎng)條件一致。感染組每只腹腔注射0.2ml病毒液（4×100TCID50CVB4），對照組每只腹腔注射0.2ml生理鹽水。分別在感染后不同時間（1、4、8、15、30及60d）處死小鼠，無菌條件分離胰腺、心臟，取血液，分別用于病毒滴度、血糖及病理變化的動態(tài)觀察。

1.5 病毒滴度的檢測 感染后不同時間取小鼠血液，分離胰腺及心肌組織并稱重，將組織碎塊置無菌離心管制成懸液，反復(fù)凍融，4℃高速離心后取上清液及血清分別進(jìn)行系列稀釋，接種單層Vero細(xì)胞96孔板，測定胰腺、心肌組織及血清中病毒的TCID50／g（ml）。細(xì)胞病變的觀察采用光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯CKX41）進(jìn)行。

1.6 病理及免疫組化分析 感染后不同時間取小鼠胰腺及心肌組織用常規(guī)方法固定、浸蠟及包埋，切片HE染色，光鏡觀察。按照SP法免疫組化試劑盒說明，用胰島素抗體對小鼠胰腺切片進(jìn)行免疫組化分析，觀察胰島素在小鼠胰腺組織的表達(dá)情況及部位。

1.7 糖耐量測定 感染病毒后60d，感染組和對照組小鼠各10只，禁食8小時，分別取血液，按血糖試劑盒說明操作，測定空腹血糖值（即0min血糖值），然后小鼠按2mg／kg體重的劑量，每只腹腔注射30%葡萄糖溶液。分別在給糖后10、30、60和120 min測血糖值，記錄血糖變化，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并繪圖。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 對感染組和對照組血糖值的統(tǒng)計分析采用配對t檢驗進(jìn)行均數(shù)比較，數(shù)據(jù)用x—±s形式表示，P＜0.05時差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 血液、胰腺及心肌組織中病毒滴度變化 小鼠感染CVB4病毒后1d血液、胰腺及心肌組織中病毒的TCID50／g（ml）均值分別為10－7.5、10－4和10－5.8，病毒滴度在感染后4d達(dá)到高峰，胰腺組織中病毒滴度最高，之后逐漸下降，至感染15d后只有胰腺組織仍有病毒增殖（見圖1）。結(jié)果表明該株CVB4對胰腺組織具有很強(qiáng)的親嗜性，而在血液及心肌組織中只是短時間存在（8、15d）。

圖1 感染組小鼠胰腺、心肌及血清中病毒滴度的變化

2.2 胰腺、心肌組織病理變化 感染組小鼠感染后8d、15d和30d的胰腺及心肌組織HE染色顯示，8d時胰腺組織病理改變?yōu)榧毙砸认傺祝夥置诓肯倥菁?xì)胞破壞，有大量淋巴細(xì)胞浸潤，胰島改變尚不明顯（見圖2－f）；心肌組織有少量淋巴細(xì)胞浸潤（見圖2－b）。15d時可見胰島萎縮，已破壞的外分泌部由脂肪組織替代（見圖2－g）；心肌組織少量充血水腫（見圖2－c）。30d時胰腺外分泌部脂肪組織增生，胰島萎縮（見圖2－h(huán)）；心肌組織已修復(fù)為正常組織結(jié)構(gòu)（見圖2－d）。圖2－a和圖2－e為正常對照組心肌及胰腺。病理變化再次表明該病毒可在胰腺組織中大量增殖，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的組織損傷，而在心肌組織中增殖較少，僅造成輕微炎癥。

2.3 免疫組化分析 用胰島素抗體進(jìn)行免疫組化分析，感染8d時，胰島分泌胰島素的量與正常對照無明顯差別（見圖2－j，圖2－i）；15d時胰島內(nèi)胰島素的分泌比正常對照明顯減少（見圖2－k）；感染30d時，受損的胰島結(jié)構(gòu)中僅有少量胰島素表達(dá)（見圖2－l）。胰島素表達(dá)的減少，說明由于胰腺組織的進(jìn)行性破壞，使胰島分泌胰島素的功能受損。

2.4 糖耐量檢測結(jié)果 感染60d時，與對照組相比，感染組小鼠注射30%葡萄糖后，0min（即空腹血糖）和10min血糖值無顯著差異（P＞0.05）；而30min后各時間點(diǎn)血糖值均顯著高于對照組（P＜0.05）（見圖3）?？梢?，由于病毒的增殖，胰腺的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致功能受損，而使感染組小鼠清除血糖能力下降，表現(xiàn)為糖耐受不良。

3 討論

本研究證實我國的CVB4流行株感染ICR小鼠，病毒在胰腺組織中滴度較高，持續(xù)增殖，并導(dǎo)致小鼠胰腺組織破壞，胰島素分泌下降，糖耐量異常。本研究發(fā)現(xiàn)該株CVB4滴度的動態(tài)變化過程，感染后第4天病毒滴度在小鼠血液、心肌及胰腺中達(dá)高峰，而一周后僅胰腺組織有病毒復(fù)制，說明病毒對小鼠胰腺組織有很強(qiáng)的親嗜性，這可能與介導(dǎo)柯薩奇病毒感染的受體，即柯薩奇病毒－腺病毒受體（CAR）的組織表達(dá)量有關(guān)［7］。研究中還發(fā)現(xiàn)在病毒感染的早期（即病毒大量增殖期），胰腺組織病理檢查表現(xiàn)為急性炎癥，胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，而病毒增殖較少的心肌組織則僅表現(xiàn)為輕微炎癥，這一方面是由于病毒的復(fù)制增殖造成了胰腺組織直接損傷，另一方面機(jī)體對大量病毒抗原的免疫應(yīng)答也間接地造成了胰腺的免疫病理損傷。另外，隨感染時間延長，發(fā)現(xiàn)受損的胰腺組織沒有像心肌組織一樣逐漸修復(fù)，而是被大量的脂肪組織所替代，胰島萎縮，殘存胰島減少。

圖2 小鼠心肌、胰腺HE染色病理切片（a－h(huán)）光鏡照片（×200）；感染后小鼠胰腺免疫組化切片（i－l）光鏡照片（×400）

圖3 感染60 d小鼠糖耐量檢測結(jié)果

為進(jìn)一步研究感染小鼠胰腺功能變化，對胰腺組織采用胰島素抗體進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果表明殘存胰島的胰島素分泌逐漸減少，說明胰島的功能受損。此后對感染小鼠糖耐量的檢測，也發(fā)現(xiàn)其對糖的清除能力明顯低于正常對照組，本研究胰島素和糖耐量的檢測結(jié)果與國內(nèi)的相關(guān)研究一致［8］。其原因首先是由于病毒的增殖直接或間接地破壞了胰腺組織，造成其功能障礙；其次胰腺外分泌部的嚴(yán)重破壞導(dǎo)致其中的胰島再生細(xì)胞減少，影響了胰島的損傷修復(fù)和再生［9］，使有功能胰島的數(shù)量減少；另外本研究中還發(fā)現(xiàn)，胰島的炎癥反應(yīng)雖比外分泌部輕微，但其功能卻受到很大影響，這是由于病毒可能以胰島素顆粒為載體來復(fù)制子代病毒，在復(fù)制增殖過程中影響了胰島素分泌和運(yùn)輸［4］，表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞分泌功能進(jìn)一步下降?？傊?，該病毒的感染破壞了小鼠胰腺的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰島素分泌減少，小鼠表現(xiàn)為糖耐量異常，說明該株病毒可能具有潛在的致糖尿病性。

腸道病毒屬于小RNA病毒，其基因組極易變異，加之地域差異，即使在同一血清型內(nèi)部也存在著廣泛的多態(tài)性，具有不同的致病特性，其中與糖尿病發(fā)生相關(guān)的病毒種類及其作用機(jī)制尚處于研究階段。本研究的結(jié)果為明確腸道病毒感染與胰島素依賴性糖尿病關(guān)系及其作用機(jī)制提供了可借鑒的實驗數(shù)據(jù)，將有助于糖尿病病因?qū)W研究的進(jìn)一步開展。

［1］Nielsen D，Krych L，Buschard K，et al.Beyond genetics，Influence of dietary factors and gut microbiota on type 1diabetes［J］.FEBS Letters，2014，588：4234.

［2］Yeung W，Rawlinson W，Craig M.Enterovirus infection and type 1diabetes mellitus：systematic review and meta－analysis of observational molecular studies［J］.BMJ，2011，342：d35.

［3］Dotta F，Censini S，van Halteren A.Coxsackie B4virus infection of cells and natural killer cell insulitis in recent－onset type 1diabetic patients［J］.PNAS，2007，104（12）：5115.

［4］Hodik M，Lukinius A，Korsgren O，et al.Tropism analysis of two Coxsackie B5strains reveals virus growth in human primary pancreatic islets but not in exocrine cell clusters in vitro［J］.Open Virology Journal，2013，7：49.

［5］Oikarinen M，Tauriainen S，Oikarinen S，et al.Type 1diabetes is associated with enterovirus infection in gut mucosa［J］.Diabetes，2012，61：687.

［6］Dahlquist G，F(xiàn)orsberg J，Hagenfeldt L，et al.Increased prevalence of enteroviral RNA in blood spots from newborn children who later developed type I diabetes［J］.Diabetes Care，2004，27：285.

［7］Bergelson J，Cunningham J，Droguett G，et al.Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2and 5［J］.Science，1997，275（5304）：1320.

［8］石艷春，李 凡，黃紅蘭.柯薩奇B4病毒體內(nèi)外感染所致小鼠胰島B細(xì)胞的損傷［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，22（1）：1.

［9］Yap I，Giddings G，Pocock E，et al.Lack of islet neogenesis plays a key role in beta－cell depletion in mice infected with a diabetogenic variant of coxsackievirus B4［J］.J Gen Virol，2003，84（11）：3051.

Mice pancreatic tissue damage induced by Coxsackievirus infection

HOU Mi，LI Zhe，WANG Yan－yan.
（Changchun MedicalCollege，Changchun130031，China）

ObjectiveStudy the association between Coxsackievirus infection and T1Donset.Methods Infect mice with CVB4strain which belongs to Human Enterovirus B group.Test the virus titre，pathological changes，glucose tolerance，and insulin secretion assays of the pancreatic tissues after infection.Results The virus titre of the pancreatic tissues was higher than that of the cardiac muscle tissues or the serum.Exocrine pancreas were damaged.Islands of pancreas were depauperated.Immunohistochemcial assays of pancreatic tissue indicated insulin secretory volume reduction.The glucose tolerance of the mouse was abnormality.Conclusion Damage and disfunction of the mouse pancreatic tissue can be induced by CVB4infection.

Coxsackievirus；pancreatic tissue；insulin

R373.2＋3

A

周密（1966－），女，博士，教授，吉林省高校新世紀(jì)科學(xué)技術(shù)優(yōu)秀人才，主要從事分子病毒學(xué)研究。

2015－01－16）

1007－4287（2015）10－1615－04

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目資助（2013540）