趙 鑫，常 穎，劉玉俠，盧衛(wèi)平，王 寶，王 哲，于 鴻，王啟文，王 斌＊

DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對腫瘤細胞殺傷作用的實驗研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，盧衛(wèi)平1，王 寶1，王 哲1，于 鴻2，王啟文1，王 斌1＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所）

目的探討DC（dendritic cells）、CIK（cytokine－induced killer cells）聯(lián)合培養(yǎng)對肺腺癌細胞A549的殺傷活性的影響，并與單獨CIK對A549殺傷活性進行比較，為腫瘤生物治療提供有效方法。方法 分別培養(yǎng)DC、CIK細胞，經(jīng)鑒定后進行聯(lián)合培養(yǎng)，聯(lián)合培養(yǎng)3天后，對A549細胞進行殺傷活性實驗，檢測DC聯(lián)合CIK及單獨CIK對A549的殺傷活性，同時用流式細胞檢測DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)細胞及單獨CIK細胞中淋巴細胞亞群的表達。結(jié)果 DC聯(lián)合CIK對A549的殺傷活性為88.38%，CIK對A549的殺傷活性為66.24%，兩者對A549的殺傷活性比較有顯著差異（P＜0.01）；DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)的淋巴細胞亞群中的CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋的數(shù)量均高于CIK細胞。結(jié)論 DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對肺癌細胞A549的殺傷活性明顯高于單獨CIK對A549的殺傷活性（P＜0.01）；抗腫瘤淋巴細胞（CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋）數(shù)量也明顯高于CIK細胞。

樹突狀細胞；CIK細胞；T淋巴細胞亞群；殺傷活性

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1636）

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是人體內(nèi)抗原遞呈能力極強的抗原遞呈細胞，它可以通過捕獲，加工腫瘤抗原，并將其遞呈給T淋巴細胞，激活機體的免疫系統(tǒng)主動攻擊腫瘤。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine－induced killer cell，CIK）是經(jīng)多種細胞因子體外誘導的以CD3＋CD56＋細胞為主的，具有強大的抗腫瘤活性的廣譜抗腫瘤細胞。本實驗利用DC、CIK細胞各自的抗腫瘤特性將DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)，檢測其體外對肺癌細胞的殺傷活性，并與單純CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性進行比較，同時檢測它們的淋巴細胞亞群產(chǎn)生的數(shù)量，分析T淋巴細胞亞群數(shù)量與殺傷活性的關(guān)系，為腫瘤病人生物治療的選擇提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

淋巴細胞分離液：購于天津灝洋生物制品科技責任有限公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4：購于Peprotech公司；IMDM培養(yǎng)基：GIBCO公司；胎牛血清：購于天津康源公司；IL－2：購于北京四環(huán)生物制藥有限公司；anti－CD3Ab：Biolegend公司。anti－h(huán)unman CD3－FITC，anti－h(huán)unman CD16、CD56－PE，購自BD公司；IFN－γ：購于上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋熒光標記單克隆抗體：購自美國BECKMAN COULTER公司；CCK8：購于上海同仁化學研究所。

1.2 肺腺癌細胞株A549

吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3 實驗設(shè)備

低溫高速離心機，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；全自動酶標儀，芬蘭雷勃公司；流式細胞儀，BD公司。

1.4 樹突狀細胞的體外誘導、培養(yǎng)

1.4.1 分離人外周血單核細胞 用Ficoll梯度密度離心法分離人外周血單核細胞，調(diào)細胞數(shù)為1× 106／ml，加到含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，放入250ml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4.2 以上分離的單核細胞培養(yǎng)1天后，加入GM－CSF（100ng／ml），IL－4（50ng／ml），TNF－α（10 ng／ml）等細胞因子，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天半量換液并補加細胞因子，誘導DC生成，7天后進行細胞表型鑒定

1.5 CIK細胞的誘導

將以上提取的外周血單核細胞培養(yǎng)1天后，加入IFN－r anti－h(huán)umanCD3、IL－1a、IL－2等細胞因子，培養(yǎng)3天后分瓶，同時補加IL－2，7天后進行CIK表型鑒定。

1.6 DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)

將以上經(jīng)過鑒定的DC、CIK按1∶5的比例聯(lián)合培養(yǎng)，3天后進行抗肺腺癌細胞A549體外殺傷實驗，同時檢測T淋巴細胞亞群數(shù)量的表達。

1.6.1 培養(yǎng)肺腺癌細胞株A549 將在液氮中凍存的A549細胞復(fù)蘇后用含10%IMDM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化，IMDM培養(yǎng)液洗滌后，調(diào)整細胞數(shù)為5×104／ml，接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl／孔，過夜培養(yǎng)。

1.6.2 DC聯(lián)合CIK以及單獨CIK對A549殺傷活性實驗 將聯(lián)合培養(yǎng)的DC－CIK及CIK分別計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為5×106／ml，按以下設(shè)計加入到已接種A549并貼壁的細胞培養(yǎng)板中，效應(yīng)細胞（DCCIK，CIK）與靶細胞（A549）的比例為50∶1，每組6復(fù)孔。

實驗分組：①DC－CIK；②CIK；③DC－CIK＋A549；④CIK＋A549；⑤A549。

以上細胞共培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束前4小時加CCK8，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標儀檢測492nm處各組光密度（OD）值，計算殺傷活性。

殺傷活性計算方法：殺傷活性＝［1－（實驗組OD值－效應(yīng)細胞OD值／靶細胞OD值）］×100% 1.6.3 檢測DC－CIK及CIK細胞中T淋巴細胞亞群 采用四色熒光標記法標記DC－CIK及CIK細胞［1］，上流式細胞儀檢測CD3＋、CD4＋、CD8＋、NK、NKT、活化T、活化B、CD8＋CD28＋的表達，用Cell Quest Pro軟件分析淋巴細胞群體百分含量。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS V16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用x—±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DC－CIK以及CIK對A549殺傷活性比較，見表1。

表1 DC－CIK以及CIK對A549殺傷活性

2.2 DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)及CIK單獨培養(yǎng)的淋巴細胞亞群數(shù)值比較，見表2。

表2 DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)及CIK單獨培養(yǎng)的淋巴細胞亞群數(shù)值

3 討論

目前，生物療法在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用，免疫治療作為生物治療的組成部分，在腫瘤治療中起著尤為重要的作用。腫瘤免疫治療的主要目的是誘導T細胞免疫反應(yīng)來控制和清除腫瘤，而這種免疫反應(yīng)的產(chǎn)生需要專職抗原遞呈細胞（antigen－presenting cell，APC）的抗原遞呈作用。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)最強的專職APC［2，3］，它可以激活初始型T淋巴細胞參與抗腫瘤反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮重要作用［4，5］。細胞因子激活的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一種抗腫瘤作用極強的腫瘤殺傷細胞［6，7］，由于其兼具有NK細胞無MHC限制性的殺瘤特點，以及T細胞特異性殺傷腫瘤細胞的功能，同樣在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。本實驗利用DC及CIK各自的抗腫瘤特性，將兩種抗腫瘤細胞共同培養(yǎng)，檢測其對肺腺癌細胞A549的殺傷活性，并與單獨CIK抗A549活性進行比較，為腫瘤生物治療提供有效方法。

本實驗通過DC聯(lián)合CIK對肺腺癌細胞A549進行殺傷活性實驗并與單獨CIK對549的殺傷活性進行比較，證明DC聯(lián)合CIK對A549的殺傷活性明顯高于單獨CIK的作用（P＜0.01），說明DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對腫瘤的殺傷作用起到了相加的作用。另外，本實驗通過檢查DC聯(lián)合CIK以及單獨CIK中淋巴細胞亞群的表達，證明DC－CIK細胞中CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋等抗腫瘤細胞數(shù)量均高于CIK細胞中的表達，這對DC－CIK抗腫瘤活性高于CIK的作用提供了支持。

淋巴細胞抗腫瘤作用的主要細胞是T淋巴細胞。CD3＋細胞是T淋巴細胞亞群的總和，在機體的免疫應(yīng)答中起著重要作用，主要參與細胞免疫，而抗腫瘤的細胞主要為T淋巴細胞。T輔助細胞（CD3＋CD4＋）能識別抗原肽－MHC－II類復(fù)合物，并通過分泌細胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，輔助誘導其它免疫細胞如殺傷性T細胞、巨噬細胞、B細胞等的增殖和分化，共同發(fā)揮抗腫瘤作用；NK細胞（CD3－CD16＋CD56＋）是機體重要的免疫細胞，其殺傷性無MHC限制，它主要作用的靶細胞有腫瘤細胞、病毒感染細胞等；NKT樣淋巴細胞（CD3＋CD16＋CD56＋）因具有NK細胞無MHC限制的殺瘤特點以及T淋巴細胞特異性攻擊腫瘤的特性而得名，它具有對CTL細胞和NK細胞抗腫瘤活性的調(diào)節(jié)能力，并能分泌TNF－α、IL－2、IFN－γ、IL－4等細胞因子；細胞毒性T淋巴細胞（CD8＋／CD28＋）是特異性抗腫瘤細胞，其數(shù)量越多，對腫瘤的殺傷力越強。DC－CIK除了高表達T淋巴細胞亞群外，其增殖率、分泌細胞因子等的能力也比CIK強［8－10］，這也是DC－CIK抗腫瘤活性高于CIK的重要因素。

本實驗的結(jié)果證明，DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)可以增加抗腫瘤細胞T淋巴細胞亞群百分比，所以其對腫瘤細胞的殺傷活性高于單獨CIK，也證明DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)可以起協(xié)同作用，提高抗腫瘤效果。

肺腺癌是肺癌的一個亞型，由于其易侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，成為臨床治療的難點。本實驗以肺腺癌細胞A549作為DC－CIK及CIK的靶細胞進行體外殺傷活性研究，希望為肺腺癌的治療提供除了手術(shù)、化療、放療等常規(guī)治療以外的治療方法，為肺腺癌的治療提供一種選擇，提高肺腺癌治療的總體療效。

［1］齊 紅，劉玉俠，任林廣，等.肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與性別、年齡及臨床分期的關(guān)系［J］.中國實驗診斷學，2012，16（11）：2034.

［2］Gilboa E.DC－based cancer vaccines［J］.J Clin Invest，2007，117（5）：1195.

［3］Curti A，Tosi P，Comoli P.et al.Phase I／II clinical trial of sequential subcutaneous and intravenous delivery of dendritic cell vaccination for refractory multiple myeloma using patient specific tumor idiotype protein or idiotype（VDJ）－derived class I restricted peptides［J］.Br J haematol，2007，139（3）：415.

［4］柯奇周，王婭蘭.樹突狀細胞在腫瘤中的研究進展［J］.國際腫瘤學雜志，2006，33（3）：179.

［5］Hao S，Bai O，Yuan J，et al.Dendritic cell－derived exosomes stimulate stronger CD8＋CTL response and antitumor immunity than tumor cell－derived exosomes［J］.Cell Mol Immunol，2006，3（3）：205.

［6］Leemhuis T，Wells S，Scheffold C，et al.A phase I trial of autologous cytokine－induced killer cells for the treatment of relapsed Hodfkin disease and non－Hodgkin lymphoma［J］.Bio Blood Marrow transplant，2005，11（3）：181.

［7］Olson JA，Leveson－Gower DB，Gill S，et al.NK cells mediate reduction of GVHD by inhibiting activated，alloreactive T cells while retaining GVT effects［J］.Blood，2010115（21）：4293.

［8］Yang L，Ren B，Li H，et al.Enhanced antitumor effects of DC－activited CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non－small－cell lung cancer patients［J］.Cancer Immunol immunother，2013，62（1）：65.

［9］Zhan HL，Gao X，Pu XY，et al.A randomized controlled trial of postoperative tumor lysate－pulsed dendritic cells and cydtokineinduced killer cells immunotherapy in patients with localized and locally advanced renal cell carcinoma［J］.Chin Med J（Engl），2012，125（21）：3771.

［10］Ren J，Di Li，Song G，et al.Selections of appropriate regimen of high－doge chemotherapy combined with adoptive cellular therapy with dendritic and cytokine－induced killer cells improved progression－free and overall survival in patients with metastatic breast cancer：Reargument of such contentious therapeutic preferences［J］.Clin Transl Oncol，2013，15（10）：780.

Experiment study of killing effect of DC and CIK co－cultured on tumor cells

ZHAO Xin，CHANG Ying，LIU Yu－xia，etal.（Jilin Province Tumor Hospital，Changchun130012，China）

ObjectiveTo discussion of cytotoxicity effects of DC（dendritic cells）and CIK（cytokine－induced cells）co－cultured on lung adenocarcinoma cell line A549，and Compare with CIK alone on A549killing activity，Provide an effective method for tumor biotherapy.Methods respectively cultured DC，CIK cell，and co－cultured after the identification，after 3days，to killing activity experiments on A549cell，detect cytotoxicity of DC joint CIK and separate CIK against A549，While using flow cytometry detect lymphocyte subsets expression of DC joint CIK and CIK alone.Results The cytotoxicity of DC joint CIK on A549was 88.38%，CIK was 66.24%，there were significant differences of cytotoxic activity on A549（P＜0.01）between，the number of lymphocyte subsets（CD3＋，CD4＋，NK，NKT，CD3＋HLADR＋，CD8＋CD28＋cell）of DC joint CIK was significantly higher than CIK.Conclusion The killing activity of DC and CIK co－cultured on A549lung cancer has significantly higher than that of single CIK cytotoxicity on A549（P＜0.01）.

dendritic cells；CIK cells；T lymphocyte subsets；killing activity

R734.2

A

2014－09－07）

1007－4287（2015）10－1636－03

＊通訊作者