高佩增，姚明曉

（1.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南250031；2.山東省疾病預(yù)防控制中心病原生物研究所）

誘導(dǎo)耐藥型宋內(nèi)志賀菌中主動(dòng)外排阻遏基因acrR、marR的變化

高佩增1，姚明曉2

（1.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南250031；2.山東省疾病預(yù)防控制中心病原生物研究所）

目的分析宋內(nèi)志賀菌在被環(huán)丙沙星誘導(dǎo)耐藥后其主動(dòng)外排阻遏基因acrR、marR突變與表達(dá)量的變化。方法 通過1／2MIC逐級(jí)誘導(dǎo)宋內(nèi)志賀菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，通過提取誘導(dǎo)株誘導(dǎo)前后DNA和總RNA，采用基因測(cè)序檢測(cè)突變和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)acrR、marR基因表達(dá)量的變化。結(jié)果 2株誘導(dǎo)耐藥株中acrR、marR中均不存在基因突變，相對(duì)于誘導(dǎo)前acrR、marR Ct值增加，基因表達(dá)量降低。結(jié)論 acrR、marR基因表達(dá)量降低間接導(dǎo)致主動(dòng)外排基因acrAB－tolC轉(zhuǎn)錄水平提高，證實(shí)了誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星激活了菌株的主動(dòng)外排系統(tǒng)。

誘導(dǎo)耐藥；主動(dòng)外排；阻遏基因；acrR；marR

Key words：Induced resistance；Active efflux；Repressor gene；acrR；marR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1625）

隨著抗生素的應(yīng)用，志賀菌耐藥現(xiàn)象逐年增加，近年來，宋內(nèi)志賀菌分離的比率逐年增高，有逐漸取代福氏志賀菌的趨勢(shì)。志賀菌耐藥機(jī)制涉及多個(gè)方面，其中，主動(dòng)外排系統(tǒng)，尤其是耐藥結(jié)節(jié)分化家族（resistance nodulation division，RND）成員對(duì)革蘭陰性菌獲得性耐藥起重要作用，acrAB－tolC是RND家族的典型代表，由藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC構(gòu)成，抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)被內(nèi)膜上的AcrB捕獲，然后AcrB與AcrA形成AcrAB復(fù)合體，再與TolC結(jié)合形成三聯(lián)復(fù)合體［1，2］，AcrAB的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，其中阻遏子基因acrR和mar－RAB操縱子的作用最為重要，AcrR抑制子是由位于泵基因上游的阻遏子基因arcR編碼的，對(duì)acrAB轉(zhuǎn)錄起一定程度的抑制作用，MarR是marRAB操縱子的阻遏基因，主要抑制marA，一旦MarA表達(dá)增加，同時(shí)引起acrA、acrB過量表達(dá)，使細(xì)菌的耐藥性顯著增加［3，4］。雖然國內(nèi)外很多單位對(duì)AcrAB－TolC進(jìn)行了研究，研究對(duì)象主要是大腸埃希菌，也有少數(shù)研究福氏志賀菌和傷寒沙門菌等［5，6］，本文通過檢測(cè)acrR和marR在菌株被環(huán)丙沙星誘導(dǎo)耐藥后基因突變與表達(dá)水平的變化，來驗(yàn)證宋內(nèi)志賀菌中主動(dòng)外排泵的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

采用我院分離的宋內(nèi)志賀菌敏感菌株（編號(hào)：22、38），以及誘導(dǎo)成功后的宋內(nèi)志賀菌耐藥菌株（22R、38R）。

1.2 主要試劑

TaKaRa Taq kit，Marker D2000，RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA E－raser（Perfect Real Time），SYBR○RPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司。E－test試條（氨芐西林、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明）購自梅里埃公司。

1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀GeneLight 2400（廈門安普利），電泳儀JY300C（北京君意），紫外分析儀JY02S（北京君意），高速低溫冷凍離心機(jī)Eppendorf 5430R（艾本德中國有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 宋內(nèi)志賀菌的誘導(dǎo) 取對(duì)數(shù)生長期宋內(nèi)志賀菌，用M－H肉湯校正濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，使菌液濃度?×108CFU／mL，稀釋200倍后終濃度為5×105CFU／mL。向菌液中加入濃度為1／2MIC0環(huán)丙沙星溶液，充分混勻后塞緊塞子，放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃振搖培養(yǎng)至細(xì)菌生長的對(duì)數(shù)期，重復(fù)以上步驟，不斷提高誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星的濃度，當(dāng)環(huán)丙沙星的濃度達(dá)到1mg／L后，濃度以1mg／L遞增，且每一濃度誘導(dǎo)兩代以確保耐藥，直至誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星濃度大于或等于128×MIC0。誘導(dǎo)過程中每誘導(dǎo)3代接種一次M－H瓊脂平板，置35℃孵育16－18h，按菌株鑒定步驟進(jìn)行生化反應(yīng)和血清型鑒定，確保誘導(dǎo)過程中菌株不被污染。

1.4.2 E－test法測(cè)誘導(dǎo)前后菌株的MIC 挑取經(jīng)35℃培養(yǎng)16－18h后的菌落，用生理鹽水調(diào)整至0.5McF。在15min內(nèi)用無菌棉試子蘸取菌液，管壁上擠去多余液體，涂布于M－H平板，平板旋轉(zhuǎn)60度涂布3次并沿邊緣涂布一圈，放置數(shù)分鐘后小心貼上E－test試條。35℃培養(yǎng)16h－18h后讀取結(jié)果。結(jié)果根據(jù)2013年版CLSI（M100－S19）標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.4.3 宋內(nèi)志賀菌總DNA的提取 用無菌棉棒挑取適量孵育16－18h誘導(dǎo)株的菌苔溶于50μl雙蒸餾水中，95℃水浴5min，12 000rpm離心30秒，含有DNA的上清液于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 acrR與marR基因擴(kuò)增與測(cè)序 根據(jù)Gen－Bank公布的acrR和marR基因序列，采用軟件Primer Premier 5自行設(shè)計(jì)引物，見表1中acrR－1與marR－1的引物序列，以總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為：5U／μl TaqDNA聚合酶0.5μl、10×緩沖液（Mg2＋plus）5μl、10mmol／L dNTP 4μl、25mmol／LMgCl22μl、10μmol／L引物5μl、模板DNA5μl、無菌雙蒸水補(bǔ)足總反應(yīng)體積為50μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性25s，55℃退火20s，72℃延伸25s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4.5 宋內(nèi)志賀菌總RNA的提取及轉(zhuǎn)錄 宋內(nèi)志賀菌總RNA提取參照RNAiso Plus試劑盒說明，取1μg總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）進(jìn)行DNA消除，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.4.6 宋內(nèi)志賀菌主動(dòng)外排基因表達(dá)水平檢測(cè)（RT－PCR） 根據(jù)GenBank公布的acrR和marR基因序列，采用軟件Primer Premier 5自行設(shè)計(jì)引物，PCR引物合成委托寶生物工程（大連）有限公司完成。RT－PCR引物序列見表1中acrR－2，marR－2。熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。25μl反應(yīng)體系中：SYBR○RPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）12.5μl，上下游引物10μM各1μl，cDNA 2 μl，dH2O 8.5μl，RT－PCR循環(huán)參數(shù)；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性25s，52℃退火20s，72℃延伸25s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。分別讀取每個(gè)菌株的acrR、marR和16sRNA的Ct值，acrR、marR的Ct值與16sRNA的Ct值之比為其相對(duì)含量，比較敏感株與耐藥株中acrR和marR的相對(duì)含量。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 環(huán)丙沙星誘導(dǎo)結(jié)果

經(jīng)過69代傳代誘導(dǎo)，環(huán)丙沙星對(duì)誘導(dǎo)菌株的MIC達(dá)64μg／mL。E－test法測(cè)定誘導(dǎo)后菌株的MIC，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過誘導(dǎo)的敏感菌株除了對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥外，還對(duì)與環(huán)丙沙星在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上都不同的其他幾種抗菌藥（氨芐西林、頭孢噻肟、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明）也產(chǎn)生了耐藥，經(jīng)過環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)，原來的敏感菌株均逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀啬退幹辍ＵT導(dǎo)前后各抗生素MIC值見表2。

表2 兩株宋內(nèi)志賀菌誘導(dǎo)前后的MIC結(jié)果

2.2 宋內(nèi)志賀菌acrR和marR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及其測(cè)序結(jié)果

2株誘導(dǎo)株均擴(kuò)增出大小分別為512bp和426 bp的片段，acrR和marR基因擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序與BLAST比對(duì)，均未發(fā)現(xiàn)有基因突變。

2.3 宋內(nèi)志賀菌acrR、marR基因表達(dá)水平分析結(jié)果

讀取每個(gè)菌株誘導(dǎo)前后acrR、marR的Ct值與16sRNA的Ct值，實(shí)時(shí)熒光定量曲線圖見圖1。根據(jù)Ct值的比值，誘導(dǎo)耐藥株的acrR、marR表達(dá)水平明顯低于敏感株，見表3。這表明誘導(dǎo)耐藥后菌株的主動(dòng)外排阻遏基因表達(dá)水平降低，相應(yīng)的主動(dòng)外排基因acrAB－tolC轉(zhuǎn)錄水平提高，證實(shí)了誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星激活了菌株的主動(dòng)外排系統(tǒng)。

表3 誘導(dǎo)前后acrR和marR的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

自Levy［7］等提出主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌主要耐藥機(jī)制之一后，一個(gè)個(gè)新的主動(dòng)外排系統(tǒng)不斷被發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)外排系統(tǒng)在臨床主要致病菌耐藥中的重要作用不斷被揭示，并為業(yè)界所認(rèn)同，是目前細(xì)菌耐藥機(jī)制研究中的新熱點(diǎn)［8］。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR曲線圖

本實(shí)驗(yàn)用環(huán)丙沙星對(duì)宋內(nèi)志賀菌敏感菌株進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥，建立環(huán)丙沙星耐藥株，意外的是誘導(dǎo)后菌株除了對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥外，還對(duì)與環(huán)丙沙星在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上都不同的其他幾種抗菌藥（氨芐西林、頭孢噻肟、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明）也產(chǎn)生了耐藥，而且這幾種藥物為主動(dòng)外排泵AcrAB的作用底物。推測(cè)這可能是由于誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星激活了敏感株的主動(dòng)外排系統(tǒng)，使敏感株變?yōu)槎嘀啬退幘辍?/p>

AcrAB的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，其中阻遏子基因acrR和marRAB操縱子的作用最為重要。AcrR抑制子是由位于泵基因上游的阻遏子基因arcR編碼的，對(duì)acrAB轉(zhuǎn)錄起一定程度的抑制作用［3，4］。AcrR通常以二聚體形式結(jié)合于acrA基因和acrB基因啟動(dòng)子附近的位點(diǎn)，抑制acrA和acrB基因的轉(zhuǎn)錄，防止其過量表達(dá)；marRAB操縱子包括啟動(dòng)子marO、阻遏基因marR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子marA和marB。該操縱子可編碼三種蛋白質(zhì)，MarR（阻遏子）、MarA（轉(zhuǎn)錄激活物）和MarB（功能不明蛋白質(zhì)），marRAB操縱子被激活后，可增強(qiáng)細(xì)菌多重耐藥性。MarR是由marR基因編碼的162個(gè)氨基酸大小的蛋白質(zhì)，它可以結(jié)合到marRAB操縱子調(diào)控區(qū)域，抑制MarA的產(chǎn)生，從而抑制主動(dòng)外排泵基因的轉(zhuǎn)錄［9］。有研究報(bào)道當(dāng)acrR或marR基因突變后，不能有效阻遏acrAB的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致acrAB表達(dá)增強(qiáng)，開啟主動(dòng)外排系統(tǒng)，導(dǎo)致因藥物外排而產(chǎn)生的耐藥［3，4，10］。本項(xiàng)目中對(duì)兩株誘導(dǎo)株中的acrR和 marR基因進(jìn)行測(cè)序，均未發(fā)現(xiàn)有基因突變發(fā)生，但通過定量分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥株中acrR表達(dá)水平下降時(shí)，細(xì)菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥，推測(cè)可能是主動(dòng)外排系統(tǒng)被激活。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)acrR和marR的基因突變，可能與實(shí)驗(yàn)株有限相關(guān)。宋內(nèi)志賀菌的主動(dòng)外排泵AcrAB－TolC的影響因素很多，外排機(jī)制比較復(fù)雜。由于宋內(nèi)志賀菌標(biāo)本較少，耐藥宋內(nèi)志賀菌標(biāo)本更難獲得，本試驗(yàn)僅就兩株誘導(dǎo)耐藥宋內(nèi)志賀菌的主動(dòng)外排泵相關(guān)的阻遏基因做了研究，將來需廣泛收集標(biāo)本，擴(kuò)大檢測(cè)例數(shù)作進(jìn)一步研究。

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Changes of repressor gene acrR and marR induced resistant Sonnei Shigella

ObjectiveTo analyze mutation and expression of repressor gene acrR and marR for acrAB－tolC efflux system before and after induced resistant to Ciprofloxacin.Methods The resistance to Ciprofloxacin was induced step by step with 1／2MIC，The total DNA and RNA was extracted from the induced and the primary strains，and then detected the acrR and marR gene mutation and expression with sequencing and real time PCR.Results The results showed that the acrR and marR were not mutated，but declined in two induced sonnei shigellacompared with the wild strains.Conclusions Its indirectly means that the acrAB－tolC transcription declined and the active efflux was activated by Ciprofloxacin.

R378.2＋5

A

2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1625－05

GAO Pei－zeng，YAO Ming－xiao.

（ClinicalLaboratory of Ji’nan Fourth People’s Hospital，Ji’nan250031，China）